原发性肝癌TACE术后复发和转移的研究进展

   原发性肝癌是我国乃至世界范围内最常见且恶性程度最高的肿瘤之一,虽然手术切除目前仍是治疗原发性肝癌的首选方法,但由于其发病隐匿,恶性程度高,确诊时多已属晚期,且大部分患者同时合并肝硬化,70~85%的患者发现后已失去手术切除的机会[1]。经导管肝动脉化疗栓塞术(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)自1979年Nakakuman等应用于临床以来,已成为治疗原发性肝癌最有效的方法之一。多年来,以TACE为主要治疗手段的介入治疗在病人的肿瘤控制和生存期延长等方面取得了很大的成绩,然而无论是手术切除还是TACE治疗,术后癌肿的复发率均很高。肝癌的复发转移与它的血管再生以及恶性程度密切相关。因此深入研究原发性肝癌复发和转移的机制,并针对此寻求有效的抗复发和转移的治疗措施成为当今肝癌研究中的热点。

   1.经导管肝动脉化疗栓塞术(TACE)的现状

   TACE的理论基础主要基于正常肝组织的血供70~75%来自门静脉,仅25~30%来自肝动脉,而肝癌的血供95~99%来自肝动脉。通过导管选择性插入肿瘤的供血动脉灌注化疗药物可使瘤区局部的药物浓度提高10~100倍,而化疗药物的全身毒副作用明显降低;同时将化疗药物和碘油混合成乳剂注入肿瘤的供养血管,在阻断肿瘤的血液供给的同时抗肿瘤药物可在肿瘤局部缓慢释放,持续地打击肿瘤,致使肿瘤细胞发生缺血性坏死并可诱导肿瘤细胞凋亡。特别是随着微导管的应用,超选择性节段性肝动脉栓塞可达到动脉与门脉双重栓塞的作用,使部分肝癌治愈。TACE的缺点是大多数肿瘤,尤其是中晚期病变不能完全坏死,需多次治疗,其原因主要与多支动脉供血、栓塞不完全及术后侧支循环形成等因素有关。此外TACE不可避免会对正常的肝实质带来损害,加重肝功能损伤,影响患者的生活质量及生存期。

   1.1 小肝癌、结节型或巨块型肝癌的TACE治疗:理想的TACE治疗是超选择插管到肿瘤的供血动脉,只针对肿瘤组织进行较彻底的化疗栓塞,因此准确的超选择插管以及对所有肿瘤供血动脉的栓塞就显得尤为重要。TACE的疗效与肿瘤病灶内的碘油沉积程度和肿瘤供养血管的栓塞程度密切相关。完全彻底的栓塞可使肿瘤坏死完全,降低复发率,影像学表现为病灶内碘油沉积均匀致密,血管造影显示肿瘤血管完全中断和肿瘤染色完全消失。对小肝癌、结节型或巨块型富血供、无门脉癌栓和动静脉瘘且肝功能较好(ChildA或B级)的肿瘤,要求能够完全栓塞,并特别强调首次治疗的彻底性和重要性,可借助于同轴微导管技术进行节段性肝动脉化疗栓塞,超选择至供养肿瘤的动脉分支,加压注入过量的碘油乳剂,同时栓塞肿瘤的动脉血供、微血管及瘤周的门静脉小分支,达到肝动脉和末梢门静脉双重栓塞目的,使瘤灶坏死更彻底。王建华等[2]对42例小肝癌采用TACE治疗后,1、3、5年生存率分别为88%、74%和51%,此结果与小肝癌手术后1、3、5年生存率分别为93.80%、75.35%和52.97%相近。Okada等[3]比较TACE治疗与手术治疗小肝癌患者存活率,TACE治疗50例Child A级肝癌患者的1、2、5年生存率分别为93.9%、74.7%、47.4%与38例手术切除治疗的Child A级肝癌患者的1、2、5年生存率分别为94.7%、82.0%、44.6%相近。陈晓明等[4]对肝癌不同方式TACE后手术切除标本的病理研究发现节段性化疗栓塞在癌灶坏死、包膜侵润坏死和门静脉癌栓坏死方面明显高于常规TACE,三者的坏死率分别为80%、71%和75%,同时发现节段性化疗栓塞的病例仅于癌周1.0cm内可见假小叶坏死及肝细胞变性与坏死,肝功能的损伤明显减小。这些研究结果比较一致,提示小肝癌采用TACE治疗能与手术媲美,病灶内碘油乳剂的完全充填是保证肿瘤坏死完全,提高疗效的基本前提。

   由于肝癌存在变异性和寄生性供血,在实施TACE治疗过程中,对病灶血管造影染色不全和碘油偏中心沉积者,应积极寻找异源供血动脉,避免遗漏[5]。由于肝癌的边缘部分是以门静脉供血为主,尤其是多次TACE后常导致肿瘤的肝动脉供血支狭窄、闭塞而门静脉供血增加。在TACE过程中,采用球囊导管暂时阻断肝静脉的方法,使窦状隙内压力增高,肝动脉与门静脉间的吻合支开放,化疗和栓塞药物进入门静脉分支,可达到双重化疗和联合栓塞的目的;另外为彻底栓塞肿瘤的供血血管,还可采用肝动脉和门静脉双重栓塞化疗术[6]。

   1.2 进展期肝癌的TACE治疗:对于进展期肝癌、肝功能情况较差或合并有门脉癌栓、肝动脉-门静脉瘘、肝动脉-肝静脉瘘者,术前周密的肝功能评估,合理的药物用量,适度的TACE治疗可提高患者生存质量,延长生存期。需要根据肿瘤大小、肝硬化程度、肝功能状况、血象、年龄及全身状况决定TACE时的药物量和间隔时间,在治疗的同时尽可能地保护患者的肝功能[6]。

   目前认为门脉一个主要分支有癌栓和主干癌栓但门脉血流存在50%以上者,只要建立起侧支循环,TACE不会引起肝缺血,如果肝功能在Child B级以上,没有严重的肝硬化,应积极采取TACE治疗,部分患者经治疗后门脉癌栓可以缩小和消失。对门静脉主干完全阻塞又无丰富侧支血管形成者应视为相对禁忌证。对肝癌合并肝动脉-门静脉瘘或肝动脉-肝静脉瘘患者,应积极地对动静脉瘘进行处理,为TACE创造有利的条件。可采用中央型栓塞剂如明胶海绵颗粒、聚乙烯醇(PVA)颗粒、不锈钢圈等堵塞瘘口,减少肿瘤区域血流及瘘口血流量,缓解门脉高压症状。关守海等[7]经微导管局部灌注无水乙醇治疗肝癌的动静脉瘘29例,瘘道闭塞率达100%,且无1例出现并发症。对动静脉瘘进行积极地处理后,能使碘油乳剂更好地在肿瘤内沉积,避免或减少了碘油导致肺栓塞或门静脉压进一步升高的危险。

   1.3 肝癌手术切除后的TACE治疗:目前对手术切除后TACE的作用仍有争论,有学者认为术后TACE虽可延缓术后肿瘤的复发,但对延长病人的总体生存并无影响;也有学者认为术后TACE可能发现一些原先未发现的小病灶,也能早期发现复发,兼有治疗及预防复发的作用[8-10]。有学者对大肝癌(>5cm)行术后TACE(136例)与术后未行TACE(718例)进行疗效比较,证实其术后5年无瘤生存率分别为26.3%和20.1%(P<0.05),病人的无瘤生存率明显提高[9]。关于术后TACE的方案并不统一,“肝癌综合性介入治疗规范化(草案)”建议[10]:肝癌切除后40天左右可行肝动脉造影,如未发现小病灶,先注入化疗药物,再注入碘油5~6mL,2~3周后复查CT,以期早期发现和治疗小复发灶,如仍未见小病灶,则分别间隔3个月和6个月行第2、3次经肝动脉预防性灌注化疗。

   1.4 TACE对肝癌生物学行为的影响:TACE术后复发和转移是十分复杂的过程,其影响因素包括肿瘤增殖的活性增加,抗凋亡基因、促血管生成因子表达,粘附因子、多药耐药基因及端粒酶异常表达及新生血管生成等。目前关于TACE对肝癌生物学行为的影响的研究主要集中在TACE对肝癌细胞凋亡、增殖和肿瘤血管生成的影响上。

   TACE可以通过多种途径促进肿瘤细胞凋亡,诱导基因表达升高,促进细胞凋亡抑制基因表达下降,从而诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖[11]。李震等[12]研究发现TACE术后高分化的肿瘤细胞大量坏死,分化差的肿瘤细胞生长加快,同时未坏死的肿瘤细胞增殖活性增强,瘤周正常肝脏可出现代偿性增生,增殖活性增强。肖恩华等[13,14]研究认为TACE可促进肿瘤凋亡,使肝癌细胞增殖指数(proliferative index,PI)梁索型、透明细胞型下降而索状腺样型、实体型和未分化型不同程度增高,使S期细胞比率(S-phase fraction,SPF)不同程度下降,说明化疗栓塞对肝癌细胞增殖活性有抑制作用,术后肿瘤的复发、转移潜能下降。TACE对肿瘤细胞增殖活性的影响存在组织学类型和病理分级的差异,Higuchi等[15]发现TACE后残癌组织Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ/Ⅳ级增殖细胞核抗原(PCNA)表达阳性率分别为37.5%、52.5%、100%,说明从Ⅰ级到Ⅳ级残癌组织增殖活性逐渐增强。研究表明TACE术后肿瘤细胞凋亡与肿瘤耐药呈负相关[16]。TACE术后残癌细胞有不同程度的多药耐药基因的表达,Ⅲ/Ⅳ级及实体型、低分化型肝癌TACE后残癌组织抗药性更高,这可能是癌细胞得以残存的原因之一,而多材料栓塞有助于降低肿瘤耐药性。

   近来研究表明TACE术后残存肝癌细胞及正常肝组织细胞的基因表达发生了变化,TACE术后残瘤组织内VEGF的表达明显高于行直接手术切除的肝癌标本组织,TACE术后所致的缺氧、营养缺乏和组织坏死等肿瘤微环境的改变均可诱导血管内皮细胞和残余癌细胞大量分泌VEGF,使肿瘤微血管增生,导致栓塞后肿瘤组织侧支循环的形成而降低栓塞效果[17,18]。栓塞后的部分肝癌组织因侧支循环建立或栓塞血管再通而发生缺血再灌注损伤,能产生大量肿瘤坏死因子-α(TNF-α),TNF-α可以诱导肝癌细胞分泌大量VEGF。Kobayashi等[19]发现TACE术后残癌组织VEGF表达增高,并且癌基因Bcl-2表达上调,诱导肿瘤细胞恶性程度增强,同时发现在Bcl-2阳性染色区,VEGF染色高于Bcl-2阴性染色区。Kim等[20]发现TACE术后缺氧促进肝癌细胞分泌VEGF和胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-2)增多,并且在IGF-2和缺氧同时作用下,VEGF的增高更明显。An等[21]研究发现肝癌TACE术后血液中VEGF含量一过性升高,二期手术切除标本中的癌细胞和瘤周肝细胞VEGF表达增强。Erber等[22]证实TACE术后残癌组织肿瘤细胞和血管内皮细胞的增殖能力明显增强,且肿瘤坏死/缺血区域直接相邻部位更加明显,表明TACE造成的缺血缺氧可以上调肿瘤的血管生成和增殖能力。

   1.5 碘油-抗癌药缓释制剂的研究现状:碘油(lipiodol,LP)是目前TACE术中应用最为广泛的末梢栓塞剂,同时碘油又可作为抗癌药物的载体,既栓塞肿瘤供血动脉又能缓慢释放抗癌药,能选择性地长期停留于肝癌组织内,栓塞与化疗相辅相成,互相促进[23]。由于当前所用抗肝癌药绝大部分是水溶性的,与亲脂性的LP混合后并不稳定,进入体内较短时间即发生突释效应,降低了肝癌组织局部的药物浓度。研究者一直在寻找新的方法以期能使碘油-抗癌药物乳剂保持稳定,滞留于肝癌局部能具有缓释效应并保持长时间有效的药物浓度。施海彬等[24]研究表明以超液化碘油(Ultra-Fluid Lipiodol,UFLP)配制的含乳化剂(Span-80)的乳剂稳定性最好,抗癌药物释放缓慢;周步良等[25]通过实验证明,碘油、抗癌药与60%复方泛影葡胺按5:3比例配制,稳定性和释放速率理想,乳粒大小适中,可达到微栓作用,克服了碘油与药物机械混合入肝后分离快的缺点,延长了局部栓塞时间及药物与瘤细胞的接触时间;且配制容易,易于推注,稳定性好,如配制中加用超声乳化方法,结果则更稳定。樊金辉等[26]对碘油-化疗药栓塞剂的颗粒直径和稳定性对TACE疗效的影响进行了实验研究,表明对碘油-化疗药混悬乳剂进行超声乳化预处理,同时采用与碘油比重相同的溶剂溶解化疗药,可以明显改进TACE的临床疗效。近年来已有新的兼具抗肿瘤活性和脂溶性的抗癌药物上市和进入临床实验,如苯乙烯马来酸新制癌菌素(SMANCS)、环乙烷二胺双十四烷酸铂-水化物(SM-11355)和1,25-二羟维生素D3(1,25(OH)2VitD3)等,由于其能稳定溶于LPD构成缓释药物,避免了在全身血液循环中的峰谷效应而发挥持续稳定的作用,因此在增加药物剂量的同时能大大降低毒副作用,从而进一步增加了以LPD为基质的抗肝癌缓释药物系统的疗效和安全性[27-29]。

   2.肝癌术后复发转移的细胞分子生物学机制

   肝癌的转移可分为肝内复发(即肝内转移)和远处转移,癌细胞可通过门静脉转移至肝的其他部位,通过肝静脉转移至远处;也可经淋巴道转移或直接侵犯邻近组织器官。癌细胞侵袭转移的能力主要由其基因型决定,由于癌细胞遗传性状的变异,使细胞与细胞间、细胞与细胞外基质(ECM)间失去粘附,癌细胞游走能力增强,细胞分泌降解ECM的酶从而穿过ECM进入血管;进入血管后抵御T淋巴细胞等的攻击,在靶器官的血管壁附着,然后再降解ECM穿出血管,在靶器官增殖;同时在VEGF等作用下,肿瘤血管生成,转移灶长大。因此肿瘤细胞间粘附作用的丧失、蛋白水解酶的合成、细胞的迁移能力增强、生长因子信号传导通路的改变、新生血管的形成、免疫识别低下等都是促进肿瘤复发转移的主要因素。

  2.1 癌基因的表达增加和抑癌基因的失活:肿瘤的侵袭转移是一个极其复杂的多基因调控和多步骤发展的过程,是通过调控转移基因的激活与转移抑制基因的失活的共同作用的结果。目前对肝癌基因表达水平的研究发现,Heparanse、mdm2、hMSH2、CD44、C-fos、C-jun、H-ras及N-ras等基因的高表达和nm23、上皮钙粘蛋白基因、细胞粘附调节基因、KAI-1、CD138以及PR-39等转移抑制基因的低表达均与肝癌的高侵袭转移能力有关。

   H-ras基因为一种原癌基因,编码分子量为21kD的蛋白质分子,能在体外诱导人肝癌细胞转移表型的产生,增强细胞的粘附能力, 促进胶原酶Ⅳ、表皮生长因子受体-1(EGFR-1)的表达,从而增强肝癌细胞转移和复发能力。mdm2基因的过度表达与肝癌侵袭性有关,在肝癌组织中mdm2基因的表达明显高于癌周肝组织,在具有肝内播散及血管内癌栓的侵袭性肝癌中mdm2基因表达显著高于非侵袭性肝癌[30]。在体内mdm2基因与p53基因间存在着一种相互调节的关系,两者间精确的平衡对P53功能的调节至关重要,mdm2可能通过使p53基因失活而增强肝癌的侵袭性[31]。Endo等[32]对检测了107例肝癌患者的手术切除标本,证实mdm2阳性与肿瘤大小、肝包膜侵犯、p53阳性相关而与是否肝硬化、肿瘤病理分级、有无卫星灶等无关,且mdm2阳性患者存活率相对较低。说明对mdm2基因尤其是mdm2基因与p53基因突变关系的研究,可能有助于了解导致肝癌高度恶性的分子机理,并有助于寻找防治肝癌侵袭与转移的新途径。

   nm23基因是一种肿瘤转移抑制基因,位于17号染色体长臂,包含nm23-H1和nm23-H2两种基因。其表达与人类的多种恶性肿瘤的侵袭转移有关。当nm23突变或缺失时,会发生纺锤体形成障碍,可引起细胞能量产生不足进而影响微管聚合,导致染色体畸变和非整倍体形成,并可引起G蛋白、Ca2+介导的对细胞信号传导系统反应的改变,引起细胞运动异常,细胞分裂加速,粘着迁移能力改变,促进肿瘤细胞的浸润和转移。Yamaguchi等[33]研究发现nm23-H1蛋白表达水平与肝癌肝内转移呈负相关。KAI-1基因是一种新近发现的肝癌转移抑制基因,Guo等[34]发现KAI-1基因在原发性肝癌组织中表达明显低于正常肝组织,而在发生转移的肝癌组织中表达也低于未发生转移的肝癌组织,提示KAI-1基因与肝癌转移有关。

   2.2 与复发转移有关的细胞因子:肝脏术后的损伤能启动肝再生机制,使肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子(TGF)、γ-干扰素(γ-INF)、粘附样表皮生长因子(HB-EGF)、肿瘤生长因子-α(TGF-α)、胰岛素样生长因子(IGF)等细胞因子水平发生了改变, 其中以HGF、TGF、IGF及其受体表达水平的变化与肝癌术后复发和转移关系最为密切。

   HGF是一种有着许多生物学活性的、多效性的多肽生长因子,在肝内主要由Ito细胞、Kupffer细胞和内皮细胞合成后,通过渗透作用进入肝癌细胞基质中使肿瘤细胞发生散射,从而增强肝癌细胞的增殖与侵袭能力。HGF受体是由c-met原癌基因编码的酪氨酸激酶受体。Ueki-T[35]等研究表明在肝癌组织中c-met存在着过表达,而且c-met过表达的肝癌细胞转移机率明显增高。TGF是由Ito细胞和Kuppfer细胞产生的调节细胞生长与分化的细胞因子,包括TGF-α和TGF-β1[36,37]。TGF-α在肝癌的血管生成及侵袭转移中起着重要的作用,主要是其随肝癌的发生、发展及其自分泌因子的产生,不断地通过内在性自分泌或旁分泌调节肿瘤细胞的生长及侵袭转移。由于TGF-α是分泌性蛋白质,故在一些肝癌病人的血、尿和培养细胞的培养液中均能检查到TGF-α的存在,因此近年来倍受重视。有学者提出TGF-α作为肝癌肿瘤标志物优于AFP,特别是肝转移癌,TGF-α和AFP联合检测能提高肝癌阳性检出率,两者能起到互补的作用,已有人提出将其列入肝癌病人的必检指标。TGF-β1可因不同时期而表现为不同的作用:在肿瘤的早期阶段,可阻断肿瘤的生长周期,为肿瘤抑制物;在肿瘤进展期,TGF-β1可由肿瘤细胞和(或)其周围的基质细胞产生,肿瘤细胞可因TGF-β1的抑制增殖的作用消失而出现优势生长;在肿瘤生长的晚期,TGF-β1作为肿瘤的促进因子,通过刺激血管生成、细胞播散、免疫抑制及合成细胞外基质等提供适宜肿瘤生长、浸润及转移的微环境[38]。IGFⅡ主要由肝脏合成与分泌,可促进肝癌细胞的增殖分化,间接提高肝癌细胞中VEGF的水平,促进肝癌的肿瘤血管形成。临床观察经TACE治疗后的肝癌病人血浆IGFⅡ水平升高,提示它与TACE术后肝癌的复发转移有关[39]。

   2.3 细胞表面粘附分子:癌细胞与细胞外基质或靶细胞间的粘附是肿瘤侵袭转移过程中的一个重要步骤,在该步骤中起主要作用的是细胞表面粘附分子,包括选择素(Selectin)、CD44家族、钙粘素(Cadherin)、整合素(Integrin)和免疫球蛋白等[40]。粘附分子的重复氨基酸序列可能是其功能区,如将这些多肽分离或体外合成能抑制相应粘附分子的功能,可在体内抑制肿瘤的转移复发[40,41]。

   E-selectin在激活的内皮细胞表达,肝细胞恶变后表达其配体sLeX抗原。肝癌细胞可通过sLeX与激活的内皮细胞膜上E-selectin识别结合,发生粘附着床,从而在肝内形成转移。故E-selectin及其配体sLeX可作为估价肝癌细胞转移潜能的指标[42];CD44可分为标准型CD44s和变异型CD44v2个亚型。已证实CD44s、CD44v可在肝癌细胞上表达,表达的CD44分子通过介导细胞与细胞、细胞与基质的粘附在肝癌的侵袭转移中发挥作用[43];E-Cadherin是一种侵袭抑制分子,通常癌旁肝细胞和高、中分化癌细胞有E-Cadherin表达,而低分化癌缺少表达,其表达与肝癌的包膜是否完整,癌细胞分化程度高低呈正相关,从而反映肝癌的侵袭转移和预后,可作为判断肝癌侵袭转移能力的一个临床指标[44,45]。

   2.4 酶类:肿瘤细胞转移过程中的一个必需步骤是必须破坏由细胞间基质和基底膜组成的细胞外基质,该过程中主要的蛋白溶酶有:基质金属蛋白酶(MMPs)、尿激酶纤溶酶激活物(uPA)、半胱氨酸蛋白酶和组织蛋白酶等。MMPs可分为4大类:胶原酶、明胶酶、基质溶解素和膜型MMP,与肝癌侵袭能力有关的MMP主要为明胶酶(MMP-2及MMP-9)[46]。MMPs参与侵袭转移的可能机制包括去除侵袭的机械性屏障,影响多种生长因子的活性,影响细胞间粘附作用和水解蛋白质释放某些生物活性物质等。MMP-2及MMP-9不但可以酶解细胞间基质成分,也是降解细胞外基质Ⅳ型胶原的主要酶。MMP活性受到金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)抑制。通过检测MMPs/TIMPs值可较好地作为癌肿浸润转移的预后指标[47];uPA是以无活性的尿激酶纤溶酶激活物前体通过自分泌和旁分泌方式分泌的,通过与糖基磷脂酰肌醇相连的尿激酶纤溶酶激活物受体结合,然后将尿激酶纤溶酶激活物前体剪切成双链酶,继而可降解循环或组织蛋白酶原,从而在肝癌的侵袭转移过程中发挥相应的作用[48];Sakamoto等[49]的研究表明酪氨酸蛋白激酶c-Src对肝癌细胞的迁移也是必需的,c-Src的活化在肝癌的复发和转移过程中起着重要作用;Kazuaki等[50]研究还提示磷脂酰肌醇-3激酶/Akt通路能调控肝癌细胞的骨架依赖性生长,在肝癌的转移和复发中也起着重要作用,这也将成为抗肝癌转移治疗的新靶点。

   3.肝癌的肿瘤血管生成

   原发性肝癌是典型的富血管肿瘤,肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的形态学基础和先决条件[51]。1996年Hanahan等[52]提出了肿瘤新生血管开关学说,认为肿瘤血管生成是许多与肿瘤血管生成有关的调节因子(包括促进血管生成因子和抑制血管生成因子)相互作用的结果。目前研究较多的肿瘤血管生成促进因子有血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板源性内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、胰岛素样生长因子(IGF)等,其中VEGF被认为是肿瘤组织中最主要的促血管生长因子,在肝癌的发生转移过程中占中心地位,并可作为衡量肝癌转移和预后的一个独立指标[53]。

   3.1 血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF):人类的VEGF基 因位于染色体的6q21,3,该基因全长28kb,编码VEGF的基因长约14kb,由8个外显子、7个内含子交替组成,序列高度保守。编码产物为34-45kD的同源二聚体糖蛋白,由两个分子量为17-22kD的相同亚基通过二硫键相连,等电点为8.5,有很强的耐热和耐酸能力,如被还原,则丧失所有生物活性[54]。由于VEGFmRNA的剪切方式的不同产生了5种多肽,分别有121、145、165、189和206个氨基酸组成,在肝癌中主要表达的是VEGF121和VEGF165[55]。VEGF的生物活性有赖于两种酪氨酸激酶受体KDR和flk-1,而在肿瘤组织中主要是KDR受体。VEGF与其受体有高度的亲和性,结合后使受体自身磷酸化而激活细胞内信号传导通路从而发挥其增加微血管通透性,诱导不同来源内皮细胞分裂、增殖、迁移的作用;同时改变内皮细胞的基因表达,产生间质胶原蛋白酶、基质降解蛋白等蛋白酶来降解基质,最终促进肿瘤血管生成[56-58]。

   VEGF诱生的新生血管基底膜极不完整,缺乏血管壁的屏障作用,这种新生血管的结构缺陷使肿瘤细胞易透过基底膜进入血循环而发生肝内、肝外转移[59]。VEGF还可增强癌细胞的迁移能力,激活细胞内p38蛋白激酶(p38MAPK),通过p38分裂原激活蛋白激酶信号传导通路,促进Ⅳ型胶原酶的分泌和细胞内肌动蛋白组成的微丝细胞骨架重排,使细胞分解基底膜胶原的能力和细胞迁移能力增强, 导致肝癌的浸润转移。Jinno等[60]报道在正常人、肝炎组、肝硬化组和肝癌组中血浆VEGF的水平依次增加,肝癌组与其他组差别明显而对照组与肝炎组和肝硬化组却无显著性差别,且血浆VEGF的水平是确定肝转移的有效指标,其特异性、敏感性和准确性均高。

   研究表明癌基因和抑癌基因的异常表达能够通过增强VEGF的表达而刺激肿瘤血管生成和肿瘤转移;Kanematsu等[61]通过观察肝癌组织和癌周肝组织VEGF表达和MRI表现的相关性,发现在MRI图像上肝癌的异质性和信号强度与肝癌VEGF表达的程度呈正相关;Yamaguchi等[58]发现随着肿瘤直径的增大,VEGF的表达水平随之降低,说明在肝癌中血管生成发生很早,尤其在小肝癌和低分化肝癌中。TACE可以影响VEGF的表达,Suzuki等[62]对34例行TACE治疗的肝癌患者进行VEGF的检测,发现TACE术7天后血浆VEGF水平明显升高,其原因在于TACE栓塞肿瘤供血动脉,造成肿瘤组织局部处于低氧状态而诱导VEGF的表达。

   肿瘤局部微环境变化可以成为血管生成的启动因素,包括酸性环境、低血糖、免疫及炎症刺激等。VEGF的表达调节较为复杂,缺氧可能是上调VEGF表达的主要原因,实验发现在低氧及坏死区域附近的组织中VEGF的表达明显升高,缺氧上调VEGF的机制可能是使VEGF基因转录活性增加和VEGFmRNA稳定性升高,而VEGF基因转录活性的增加和缺氧诱导因子(HIF-1)有关,HIF-1通过与VEGF启动子中的低氧反应元件结合而上调其表达[63]。

   3.2 缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors,HIF):HIF是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物与人体内的一类转录因子,是由结构同源的α亚基和共同的β亚基组成的异源二聚体,包括HIF-1、HIF-2与HIF-3。其通过对缺氧诱导基因表达的调节,在维持机体对缺氧的适应能力中发挥重要作用。近来发现HIF表达影响多种血管生成因子的转录,对缺氧环境下肿瘤血管生成的调节发挥重要作用。多项研究表明HIF-1可调节VEGF等多种与肿瘤相关的靶基因,促进这些基因的转录,介导组织细胞产生一系列的缺氧适应反应,对多种实体瘤组织标本的免疫组化检测发现HIF-1α蛋白的高表达与肿瘤的分级、血管形成、能量代谢、侵袭转移等密切相关[64]。

   HIF-1由120kD的α亚单位(HIF-lα)与91-94kD的β亚单位(HIF-1β)组成。HIF-1α是 HIF-1的氧调节亚单位,氧主要通过该亚单位来调节HIF-1的生物活性。HIF-1不仅是调节氧动态平衡的关键因子而且与肿瘤的演进关系密切。抑癌基因的失活、癌基因的激活不仅可提高HIF-1α蛋白表达的水平,而且可提高它的转录活性[65],而HIF-1α通过激活一系列靶基因促进肿瘤生长,如通过促进VEGF转录,加快肿瘤血管生长,通过提高葡萄糖转运和糖酵解的酶活性,使肿瘤细胞代谢改变以便适应周围环境的变化。Kurokawa等[66]对多种实体肿瘤组织标本的免疫组化检测发现,HIF-1α蛋白的高表达与多种实体肿瘤的分级、血管生成和转移密切相关。有研究证实在肿瘤坏死明显的区域、肿瘤浸润边缘及肿瘤血管周围HIF-1α表达明显增高,而在肿瘤邻近的正常组织未见HIF-1α的表达,且发生转移者明显高于未转移者,提示HIF-1α可预测肿瘤的侵袭转移,是判断肿瘤预后的一个重要指标[64]。丁磊[67]等通过检测肝癌及癌旁组织中HIF-1α蛋白的表达,发现HIF-1α在肝癌和肝硬化组织中普遍表达且只受缺氧因素的影响,与肿瘤的分化程度和转移有关。缺氧时HIF-1α还可上调肝癌细胞内MDR-1、MRP-1、LRP等多药耐药相关基因的表达,从而使肝细胞癌获得多药耐药性[68]。

   HIF-1调节肿瘤血管形成的机制包括VEGF依赖途径和VEGF非依赖途径(通过促进其他因子表达或癌基因发挥作用)。HIF-1通过调控编码VEGF的基因使VEGF呈高表达并进一步促使血管生成,其机制为HIF-1与一种特异的DNA低氧性应答物质连接,促进VEGFmRNA转录,并使VEGFmRNA稳定性增加[69]。

   4.肝癌复发转移的抗血管生成治疗

   肿瘤血管生成在肝癌的发生、发展和转移过程中发挥了重要作用,而肝癌TACE术后肿瘤的复发和转移也与TACE术后侧支循环的建立和肿瘤血管生成有着密切的关系,目前以肿瘤血管内皮细胞为靶点的抗血管生成治疗成为肝癌治疗研究的热点。

   抗肿瘤血管生成多通过抑制基底膜降解、抑制血管生长因子活化、抑制内皮细胞特异性整合素和直接抑制内皮细胞等途径发挥作用。因其主要作用于肿瘤间质,故可长期用药不易产生耐药性,抑瘤谱广并可与其他药物同时使用,特别是抗血管生成基因治疗疗效相对持久,不需经常注射外源性药物以维持有效浓度,靶向性更为明显,对正常组织血管生成的影响较小,能在分子水平阻断肿瘤的发生与发展,具有广阔应用的前景[70]。

   4.1 药物治疗:包括①抑制血管内皮细胞药物:O-(氯乙酰-氨甲酰基)烟曲霉醇(TNP-470)、血管抑素(angiostatin,AS)和内皮抑素(endostatin,ES)、非甾体类消炎药(NSAID)、IL-2等。②抑制基底膜降解的药物:基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)包括Marimastat(BB2516)、Batismastat(BB94)、Thrombospondin、AG3340、BB3644等。③抑制血管生长因子活化药物:反应停(thalidomide)、干扰素(interferon,IFN)、铜鳌合剂、三氧化二砷(As2O3)、抗VEGF单克隆抗体、信号传导抑制剂SU5416和6668等。

   TNP-470能阻断新生血管内皮细胞的DNA复制,抑制微血管的增生[71]。动物实验发现TNP-470也能抑制实验鼠AH-130细胞株肝移植瘤及CDAA诱导的肝癌血管生成和肿瘤生长,而对肝功能及肝细胞再生无明显影响[72];TIMP能阻断MMP降解细胞外基质成分,从而抑制肿瘤的转移和新生血管的产生。Marimastat是一类异羟酸衍生物,其结构类似于间质组织胶原酶降解的胶原分子起始段,能可逆的结合MMP含锌离子的活性区从而抑制其活性[73]。Giannelli等[46]认为,MMP-2/TIMP-2可能反应宿主-肿瘤间的相互作用,调控肿瘤转移,MMP-2蛋白分解活性与TIMP-2抑制活性失衡决定细胞外基质降解;IFN具有抗增殖活性,通过抑制内皮细胞和肿瘤细胞迁移,下调bFGF转录等发挥血管生成抑制作用。Lin等[74]报道IFN-α可抑制肝癌消融术后的复发和转移;As2O3俗称砒霜,我国学者将As2O3用于白血病的治疗取得了令人瞩目的成就,近年来发现其对肝癌有独特的治疗作用,大量的体外和动物试验研究证明As2O3除具备一般化疗药物的细胞毒性作用外,还具有抑制肝癌细胞端粒酶活性、选择性诱导肝癌细胞凋亡和独特的抗肿瘤血管生成作用[75-77]。黄介飞等[78]通过应用亚砷酸注射液治疗大鼠原发性肝癌模型的研究发现,As2O3可通过抗肿瘤细胞增殖和促进凋亡发生两条途径来发挥其宜抑癌作用,其突出的特点是中剂量As2O3(1mg/kg)治疗组出现G2/M期阻滞现象;同时发现As2O3能通过抑制VEGF合成间接抗肿瘤血管形成。陈惠英等[79]采用免疫组化染色S-P法对As2O3影响人肝癌细胞株VEGF的表达进行研究,发现人肝癌细胞株Bel-7402细胞的VEGF表达明显受到抑制。体内外实验也证实As2O3可诱导血管内皮细胞凋亡和促使肿瘤血管闭塞[80,81]。

   4.2 基因相关治疗:目前基因相关抗肿瘤血管生成治疗主要通过以下途径:①中和促血管生成因子或下调促血管生成因子的表达。利用工程技术制备促血管生成因子单克隆抗体,直接与相应促血管生成因子结合而抑制其发挥作用。也可通过引入抑癌基因或通过其他方式抑制促血管生成因子的表达。②利用基因转移技术导入血管生成抑制因子表达基因,诱导血管生成抑制因子的合成。目前应用该法治疗肝癌已有成功的报道[82]。③采用基因重组方法诱导可溶性受体的产生,竞争性结合促血管生成因子,降低其与内皮细胞相应受体结合机会。Tanaka等[83]报道,在鼠MH134肝癌细胞株中导入可溶性Tie-2受体(sTie-2)DNA表达质粒,14天后肿瘤血管内皮细胞CD31显著减少,肿瘤生长明显受抑制。④反义基因疗法和核酶技术。反义基因疗法是采用与某些癌基因或生长因子基因互补的RNA或DNA,将其导入肝癌细胞后,可与靶基因的mRNA或其前体hnRNA互补结合,影响mRNA的成熟及翻译,达到抑制靶基因表达的作用。Kang等[84]报道将构建的VEGFcDNA的反义核苷酸:pZeoVEGF导入鼠SK-HEP1肝癌模型中,发现它能有效地抑制VEGF合成。核酶是一种具有剪切能力的RNA,利用其与底物的碱基配对特异性,经设计后使之结合并剪切靶基因(如癌基因),从而使之破坏而达到抗肿瘤目的。有学者[85]报道将抗VEGF核酶导入HLF细胞系后,能显著降低VEGFmRNA及VEGF水平,成为肝癌治疗的又一途径。

   目前抗肿瘤血管生成治疗手段正处于动物实验及临床试验阶段,尚未在临床上广泛应用,肿瘤血管生成信息通路和调控机制的研究仍需进一步深入,但可以预期与手术治疗,放、化疗及介入治疗联合使用,特别是与TACE联合应用将是抗肝癌肿瘤血管生成治疗的发展方向。将血管生成抑制剂与碘化油混合后行肝动脉栓塞,可利用碘化油混合液长时间地沉积在肿瘤区域,具有高度靶向性的优势,一方面TACE能利用化学药物直接抑制和杀死肿瘤细胞,栓塞肿瘤血管使肿瘤缺血坏死;另一方面血管生成抑制剂长时间与肿瘤细胞和肿瘤血管有效接触,可从分子水平抑制血管生成,使血管内皮细胞休眠、衰老或凋亡,减少肿瘤新生血供和抑制肿瘤侧支循环生成,从而减少肿瘤的复发和转移。曹玮等[86]对VX2瘤细胞兔肝癌模型分别经肝动脉行TNP-470灌注、碘化油栓塞、碘化油与TNP-470混合栓塞以及灌注生理盐水对照,结果显示碘化油与TNP-470混合栓塞可有效地抑制肿瘤的生长,肿瘤体积生长率和存活期与其他组相比均具有显著性差异;而Ma等[87]对VX2瘤细胞兔肝癌模型分别行TACE和TACE术后3天TNP-470静脉注射,其结果亦显示后者的肿瘤坏死率和肿瘤的体积缩小率都较前者有显著性差异,并且肝内转移和肺转移也有显著性差异。可以预期抗肿瘤血管生成的基因治疗和手术及介入治疗的结合将有可能成为未来治疗肝癌的最佳途径。




    2014/2/10 11:08:12     访问数:917
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