骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞移植促进血流重建的比较

摘要 目的:比较骨髓间充质细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BM /MSC)和骨髓源内皮祖细胞(Bone Marrow Endothelialprogenitor cells, BM /EPC) 移植促进血流重建的效果,为进一步优化骨髓干细胞移植治疗肢体缺血提供理论基础。方法:获取Lewis 大鼠骨髓单个核细胞,在体外培养分化为MSC 和EPC。采用Lewis 大鼠建立单侧后肢缺血模型。在模型建立后3 天,将0.8mlD-Hanks 液注入大鼠缺血侧后肢,为对照组(n=6);将8×106 个骨髓MSC 植入大鼠缺血侧后肢,为MSC 组(n=6);将体外培养的8×106 个EPC 植入大鼠缺血侧后肢,为EPC 组(n=6)。细胞移植后3 周行缺血大鼠后肢动脉造影,检测缺血侧后肢侧支血管数;获取缺血侧后肢腓肠肌,分别行CD31 和α-SMA 免疫组化染色,计算毛细血管密度和小动脉密度。结果:MSC 组与EPC 组侧支血管数无显著性差异,二者均高于对照组;EPC 组毛细血管密度明显高于MSC 组,二者均高于对照组;MSC 组与EPC 组小动脉密度无显著性差异,二者均高于对照组。结论:骨髓间充质干细胞移植和内皮祖细胞移植均能够明显促进血流重建,而且骨髓间充质干细胞在治疗肢体缺血性疾病中的优势应该受到重视。
关键词::间充质干细胞;内皮祖细胞;细胞移植;肢体缺血

一、前言

   内皮祖细胞被认为是促进血管新生的主要效应细胞,是细胞治疗促进血管新生优先考虑的候选细胞。目前间充质干细胞在促进血管新生中的作用日益受到重视。本研究通过对骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞在促进血流重建方面的作用进行比较,探讨在不同种类细胞移植治疗肢体缺血性疾病中的作用,为进一步优化骨髓干细胞移植治疗肢体缺血提供理论基础。
1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂Lewis 大鼠24 只,SPF 级,雄性,体重200~250g,平均225g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。DMEM 低糖培养液及EBM-2 培养液(Lonza, 美国)、Ficoll 淋巴细胞分离液(Sigma, 美国)、D-Hanks 液(Invitrogen, 美国)、乙酰化的低密度脂蛋白( Molecular Probe, 美国)、异硫氰酸荧光素- 荆豆凝集素-1(Sigma, 美国)、CD29、CD44、CD34、CD45 单抗及荧光标记二抗(BD, 美国)。10%水合氯醛(首都医科大学宣武医院配制)、复方泛影葡胺注射液(上海旭东海普药业有限公司,中国)。

1. 2 实验方法和步骤

1.2.1 骨髓单个核细胞的的制备取6 只Lewis 大鼠,过量麻醉法处死,取出股骨,用D-Hanks 液冲洗骨髓腔获取细胞悬液,并将其加入等体积Ficoll 淋巴细胞分离液中,通过密度梯度离心法获取单个核细胞。备行骨髓MSC 和EPC 的培养与移植。
 
1.2.2 MSC 的培养与检测按上述方法获取骨髓单个核细胞。将单个核细胞按106 / cm2 接种在培养瓶中,加入含10%FBS 的DMEM 低糖培养液,置37℃、5%CO。孵箱培养。培养48 h 后换液,丢弃未贴壁的细胞,以后每3 天换液1 次。待细胞长至90%融合时传代,第2 代培养后进行MSC 的鉴定与移植。取3份样本重复测定,细胞表达CD29,CD44,但不表达CD34,CD45。

1.2.3 EPC 的培养与鉴定按上述方法获取骨髓单个核细胞。将相同数目的单个核细胞按106 / cm2 接种在培养瓶中,加入EBM-2 培养液,置37℃、5%CO 孵箱培养。4 天后换培养液继续培养至7 天,7 天后用D-Hanks 液洗掉非贴壁细胞。待贴壁细胞长至90%融合时传代,第2 代培养后进行EPC 的鉴定与移植取部分贴壁细胞用终浓度为10ug/ml 的Dil-AcLDL 在37℃温育1 h,然后用2%多聚甲醛固定10min,再用终浓度为10ug/ml 的F ITC-UEA-1 温育1 h,双染色阳性者为正在分化的EPC。

1.2.4 单侧后肢缺血模型的制备与分组取18 只Lewis 大鼠,随机分为对照组、MSC 组和EPC 组(n=6)。实验大鼠用10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔麻醉满意后,在无菌条件下沿左侧后肢腹侧做切口,结扎并切除股总、股浅动脉和股深动脉及其主要分支。确定后肢缺血模型制备成功后继续饲养。在缺血模型建立后3 天将0.8mlD-Hanks 液、含8×106 个MSC 和EPC 的0.8mlD-Hanks 液,分别注入对照组、MSC 组和EPC 组大鼠缺血侧后肢的肌肉内,然后继续饲养3 周。

1.2.5 检测指标细胞移植后3 周,大鼠麻醉满意后开腹,用静脉留置针穿刺腹主动脉并固定,注入4ml 复方泛影葡胺注射液在数字减影血管造影机下行血管造影。在DSA 片上经缺血侧股骨中点划1 条垂直与股骨纵轴的直线,计算通过该横线的血管数,以所计得的侧枝血管评价EPCs 体内促侧支血管生成的能力。获取缺血侧后肢腓肠肌,分别行CD31 和α-SMA 免疫组化染色,计算毛细血管密度和小动脉密度。

1.3 统计学分析采用SPSS11.5 统计软件进行统计学分析。数据以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,P 值<0.05 认为有统计学意义。

2 结果

2.1 缺血后肢侧支血管数目的变化MSC 组与EPC 组侧支血管数无显著性差异,二者均高于对照组(见表1)。

2.2 缺血后肢毛细血管密度的变化EPC 组毛细血管密度高于MSC 组,具有显著性差异,二者均高于对照组(见表1)。

2.3 缺血后肢小动脉密度的变化MSC 组与EPC 组小动脉密度无显著性差异,二者均高于对照组(见表1)。


3 讨论

   目前研究认为EPC 是促进血管新生的主要效应细胞;而间充质干细胞在促进血管新生中的作用在其发现之初就得到认识。1974 年,Friedenstein 发现了骨髓间充质干细胞,该类细胞的特点包括能够支持造血干细胞的生长及具有多向分化潜能。间充质干细胞在骨髓单个核细胞中仅占1/1000,000,而且随着年龄的增长该细胞占单个核细胞的比例逐渐减少。间充质干细胞的表面标志区别于内皮细胞、造血干细胞和单个核细胞,目前认为间充质干细胞表面标志为CD44、CD73、CD90 和CD105,而不表达CD45(造血干细胞表面标志)、CD31 和血管性血友病因子(内皮细胞表面标志)和CD11b/MAC-1(巨噬细胞表面标志)。
   内皮祖细胞在促进血管新生中的作用及其机制已有较多的研究,本文不再赘述。间充质干细胞在促进血管新生中的作用日益受到重视。有文献报道间充质干细胞移植能够明显促进受体本身的血管新生。对间充质干细胞进行基因和蛋白水平的研究发现其能分泌多种与血管生成(Angiogenesis)有关的细胞因子,包括VEGF、FGF、IL-6、MMPs、HGF 和IGF。间充质干细胞在还可分泌在动脉生成(Arteriogenesis)过程中的关键细胞因子,包括MCP-1、Angiopoietin-1、PDGF 。有文献发现单独应用间充质干细胞所分泌的细胞因子也能够促进治疗性的血管生成(Angiogenesis)。所以说间充质干细胞通过多种途径促进血管新生。
   尽管本研究的结果提示在一些评价血流重建的指标上,与内皮祖细胞移植比较间充质干细胞移植没有表现出优势,甚至在某些方面还不如内皮祖细胞移植。但结合文献作者认为间充质干细胞在促进血管新生方面仍较内皮祖细胞具有较大的优势。

   其主要原因有以下几个方面。一、间充质干细胞来源广泛,容易获得,易于应用于临床;二、在移植细胞制备的方法上间充质干细胞的体外纯化扩增简便,易于应用于临床;三、更重要的是间充质干细胞具有免疫方面的优势,包括免疫调节作用和" 免疫特惠"。幼稚的间充质干细胞缺乏MHCII 和共刺激分子(CD80/CD86)的表达,因此被认为是" 免疫特惠" 细胞,甚至就像O 型血一样。甚至有报道间充质干细胞能够进行异种移植。在细胞治疗领域间充质干细胞越来越受到重视被认为是" 细胞生物药剂" 的重要细胞用于多种疾病的治疗。间充质干细胞的这一特点为其产业化提供可能;四、间充质干细胞具有较强的多向分化潜能,例如间充质干细胞不仅能够分化为内皮细胞,还能够作为周细胞参与血管形成。从血管壁的组成角度血管新生不仅仅是内皮细胞,还应该包括其他类型的细胞的参与。五、间充质干细胞具有较强的旁分泌作用,为血管新生的复杂过程提供支持。
   目前世界范围内有200 多个临床试验用间充质干细胞治疗多种疾病,其中包括缺血的治疗。当然目前间充质干细胞的临床应用还有诸多问题需要解决,包括其不能在预期的局部持续发挥作用,另外在应用间充干细胞进行异体移植时的免疫源性仍不容忽视。

    2013/12/26 11:09:16     访问数:916
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