用斑马鱼模型研究SLC33A1基因在遗传性痉挛性截瘫发生中的作用

   本课题组在前期工作中发现了一个新的遗传性痉挛性截瘫(HSP)的致病基因-SLC33A1,HSP是一组发病率较高、且有很强遗传异质性的疾病,鉴于目前 SLC33A1 体内功能研究的缺乏及斑马鱼在运动神经元疾病研究中的成功应用,本课题以脊椎动物斑马鱼为模型,研究 Slc33a1 对脊椎动物运动神经元的影响,探讨 SLC33A1 基因 p.S113R 突变在遗传性痉挛性截瘫发生中的作用及可能机制。
   研究分以下三部分:
   第一部分 斑马鱼 slc33a1 基因及其表达分析 
   本研究选择斑马鱼模型作为研究对象,首先分析了斑马鱼 slc33a1 的蛋白结构及其在发育过程中的表达模式:
   我们从Genbank数据库中调阅了斑马鱼、小鼠和人类 SLC33A1 的氨基酸序列,进行同源性比较,结果显示斑马鱼 Slc33a1 蛋白与人类和小鼠SLC33A1 蛋白高度同源,说明 SLC33A1 在进化上是高度保守的。
   已知 SLC33A1 蛋白是一个膜蛋白,膜蛋白二级结构预测显示斑马鱼 Slc33a1 蛋白与人类蛋白一样含有 12 个跨膜结构域,其跨膜结构、胞外结构及胞内结构与人类蛋白也极其相近,提示两者蛋白功能是相似的,斑马鱼可以作为研究人SLC33A1 功能的模型。
   随后我们采用实时定量 PCR 方法检测了斑马鱼发育过程中各个时期slc33a1 基因 mRNA 表达水平,结果发现各发育阶段均有持续性表达且表达水平无明显变化。同时根据国际权威斑马鱼数据库 zfin.org 提供的 slc33a1 mRNA 原位杂交数据,slc33a1 是一个广泛表达的基因,这也与人类的表达谱很近似。提示我们可以使用斑马鱼作为研究 SLC33A1 的模型。
   第二部分 Slc33a1 knockdown 斑马鱼的表型分析
   Morpholino 是一种反义寡核苷酸技术,它可以与靶序列即某一 RNA 通过碱基互补配对的原则牢固结合,通过空间位阻效应妨碍翻译起始复合物的形成及移动,从而阻断蛋白质翻译过程达到抑制目标基因功能的目的。我们首先使用该技术构建了 slc33a1 功能研究的斑马鱼模型,随后针对 HSP的临床表现、病理特征、结合已有运动神经元疾病斑马鱼模型的研究成果对该模型从整体到微观多个层面进行了观察分析:
   设计合成了针对斑马鱼 slc33a1 mRNA 的 Morpholino 及对照,通过显微注射 slc33a1 MO 至斑马鱼受精卵能够建立 SLC33A1 功能研究的动物模型。
   Slc33a1 knockdown 的斑马鱼在发育的早期就表现出不同程度的尾部发育不良及尾部弯曲表型,同时伴随着一定比例斑马鱼的死亡,这与遗传性痉挛性截瘫 SPG4、SPG8、SPG11 斑马鱼模型是相似的。说明SLC33A1 是影响早期发育的重要因素;
   Slc33a1 knockdown 的斑马鱼出现显著的运动能力下降,表现为 touch-evoked swimming 运动的异常,这与遗传性痉挛性截瘫 SPG4、SPG11 和SPG3A的斑马鱼模型是一致的;
   显微注射 slc33a1 MO斑马鱼出现初级和次级运动神经元轴突生长异常,表现为轴突截短和分叉增多,中枢神经系统中脊髓和后脑的运动神经元排列紊乱甚至缺失。说明 Slc33a1 对运动神经元及其轴突的生长发育至关重要。运动神经元疾病主要的病理改变为上/下运动神经元及其轴突的退行性变,而目前所有的 HSP 和ALS 的斑马鱼模型均有轴突异常的表型。
   第三部分 用斑马鱼模型证实 SLC33A1 基因 p.S113R 突变是致病突变 
   本课题组前期报道了一遗传性痉挛性截瘫家系患者携带 p.S113R 突变,经过生物信息学分析发现,该位点及其附近氨基酸在进化上高度保守,且软件预测该突变会引起 SLC33A1 蛋白跨膜结构域的改变从而影响其正常功能。为了明确 p.S113R 的致病性及突变性质,我们利用斑马鱼模型进行了以下研究:
   首先构建了人野生型 SLC33A1 和携带 p.S113R 突变的人 SLC33A1 表达载体,载体质粒经过线性化后经体外转录获得人野生型和突变型 SLC33A1 mRNA;
   通过两种 RNA 与 slc33a1 MO 共注射,分析了 p.S113R 突变的性质。结果显示人野生型 SLC33A1 mRNA 可以拯救 slc33a1 knockdown 造成的尾部弯曲和轴突发育的异常,而人突变型SLC33A1 mRNA则没有拯救效果。说明p.S113R 是致病突变,另一方面也证实了 slc33a1 MO 的有效性和特异性;单独注射携带 p.S113R 突变的人 SLC33A1 mRNA,斑马鱼并没有出现明显的发育上异常,提示该突变是一个功能丧失性突变(loss of function)。  
   综上所述,我们采用斑马鱼模型进行了 SLC33A1 基因功能的体内研究。Slc33a1 knockdown 的斑马鱼出现尾部发育不良、运动能力低下、运动神经元轴突生长异常等表型。利用该模型证实了 SLC33A1 基因的 p.S113R 突变是一个功能丧失性突变。这些发现将有利于更深入地认识遗传性痉挛性截瘫、肌萎缩侧索硬化等以运动神经元病变为特征的神经退行性疾病的发病机制,而斑马鱼模型的建立也为开发新的治疗方法和药物筛选奠定了基础。



    2013/11/19 12:47:54     访问数:943
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