基于代谢组学的中医心病(心气不足证)证候研究

【摘要】目的:通过代谢组学的先进研究技术寻找中医心病(心悸、胸痹)心气不足证患者血浆及尿液代谢组学标志物,探寻中医同证异病的本质,为中医客观化研究寻找新的切入点。方法:选取健康志愿者、胸痹心气不足证(不稳定型心绞痛)、胸痹心气不足证(陈旧性心肌梗死)、心悸心气不足证(室性早搏)患者各10例,采用液质联用、气质联用技术观察中医心病心气不足证尿液代谢物成分于正常健康人的差别,采用主成分分析、偏最小二乘判别法进行分析,寻找出中医心气不足证代谢组学标志物。结果:1、采用液质联用技术研究血浆的胸痹(不稳定型心绞痛)患者组代谢产物中神经酰胺、甘氨胆酸、别胆酸、石胆酸、白三烯B4比健康对照组组有明显升高。2、采用气质联用技术研究血浆的胸痹(陈旧性心肌梗死)患者组代谢产物中甘氨胆酸、别胆酸、石胆酸、比健康对照组有明显升高3、采用气质联用技术研究尿液的心悸(室性早搏)患者羧酸酯、酰基辅酶A脱氢酶、异戊酸、酰基肉碱比健康对照组明显下降。结论: 1、神经酰胺、甘氨胆酸、别胆酸、石胆酸、白三烯B4可能是中胸痹心气不足证前列腺素可能是胸痹心气不足证血浆代谢组学标志物。2、羧酸酯、酰基辅酶A脱氢酶、异戊酸、酰基肉碱可能为心悸心气不足证的潜在标志物。

关键词:胸痹  心悸  心气不足  代谢组学

辨证论治是中医诊疗疾病的特点,其动态演化性是核心问题,证候范畴中的所有因素随着时间的推移,在方式、程度、速度等方面都会发生无穷多样的变化是一个不断变化的矛盾过程,具有动态时空的特征中医的辨证论治思维方式与代谢组学对疾病的研究方法具有相似之处。两者都遵从人体是一个有机整体,通过整合已经发生结果的生物体系输出的多维信息,逆向分析其内在的动态联系。缺血性心脏病包括原发性心脏骤停,心绞痛,心肌梗死,心力衰竭,心律失常这些都是以冠脉循环改变引起冠脉血流和心肌需求之间不平衡而导致的心肌损害,在临床工作中可以看到缺血性心脏病各个时期的动态演变过程,这恰恰与中医理论中同证异病相符合,本研究目的在于观察胸痹心气不足证患者在心肌损伤程度不同的各个时期血浆代谢组学的变化,找出缺血性心脏病心气不足证患者的共同的标志性血浆产物,横向观察各类缺血性心脏病患者代谢组学差别以及各自的标志性代谢产物谱。最终明确中医心病心气不足证的症候本质以及具体的演化过程从而为临床提供有力的理论基础。这对对中医药理论的现代化,国际化,中医药走向世界同样具有重要的意义。

研究一 不稳定型心绞痛患者血浆代谢组学研究

材料与方法

1 试剂和器材      

乙酸铵

Tedia公司

乙腈

Merck公司

甲酸

Tedia公司

U3000HPLC API 3200三重四级杆液质联用仪   美国戴安公司

CR21型低温高速离心机

日本日立公司

MDF-U50V超低温冰箱

日本三洋电子有限公司

的XW-80A型旋涡混合器

上海医科大学仪器厂

2方法

2.1研究对象选择及分组

本研究入选的30例患者均是来自2009年11月至2012年7月黑龙江中医药大学第一附属医院住院及门诊患者,将入选患者随机分为3组:胸痹不稳定型心绞痛组10例,胸痹陈旧性心肌梗死组10例,心悸室性早搏组10例。随机号码查随机数字表产生。同时根据知情同意以及伦理学原则招募健康志愿者。

2.2入选标准

2.2.1西医诊断标准

不稳定型心绞痛、陈旧性心肌梗死参照1979年国际心脏病学会和协会及世界卫生组织临床命名标准化联合专题组报告《缺血性心脏病的命名及诊断标准》制定,即除外典型的稳定型劳力型心绞痛之外的所有心绞痛类型。

室性早搏参照陈翻珠主编的第5版《实用内科学》a.提前发生的QRS波辟;b.时限通常超过0.12s,宽大畸形;C.ST段与T波的方向与 QRS波群主波方向相反。室性早搏的美国 Lown分级标准如下:0级:无室性早搏;I级:偶发,每小吋<30次或每分钟< 1次;II级:频发,24小时> 720次或每小时>30次或每分钟>6次;III级:多源性室性早搏;IVA级:成对的室性早搏,反复出现;IVB级:成串的室性早搏(三或三个以上室性早搏)反复出现;V级:期前收缩的R波落在前一个窦性激动的T波上(R ON T)。

2.2.2中医诊断标准

胸痹参照2002年《中药新药临床研究指导原则》中有关冠心病心绞痛中医证候诊断标准及1990年中西医结合心血管学会修订的《冠心病中医辨证标准》制定。本研究选取以“气虚血少,血液运行无力,心神失养”为病机的胸痹患者。

心悸参照参照2002年《中药新药临床研究指导原则》中关于治疗气虚证、血虚症的临床研究指导原则。a.主症:心悸。b.次症:胸闷、失眠、健忘、神疲乏力、气短、懒言、自汗。C.舌脉:舌质淡,脉细弱结代。具备主症和2项次症,结合舌、脉象就可诊断。

2.2.3纳入标准

(1)年龄在40~70岁之间。

(2)符合冠心病不稳定型心绞痛、心肌梗死、室性早搏西医诊断标准。

(3)不稳定型心绞痛的静息心电图阳性(ST段压低≥0.05mv和/或R波为主导联T波倒置且深>0.1mv)。

  陈旧性心肌梗死的静息心电图异常Q波,心肌梗死病史1年以上。

  室性早搏的心电图诊断标准

(4)符合中医心病心气不足证中医诊断标准。

(5)签署知情同意书。

2.2.4排除标准

(1)经检查证实为冠心病急性心肌梗塞,稳定型劳累性心绞痛以及其他心脏疾病、神经官能症、更年期症候群、甲亢、胃及食管反流、食道裂孔疝、主动脉夹层等所致胸痛者。

(2)未得到控制的高血压患者者(收缩压≥160mmHg或舒张压≥100mmHg)、重度心肺功能不全、重度心律失常(快速房颤、房扑、阵发性室速等)、完全性束支传导阻滞、糖尿病严重并发症者。

(3)合并肝、肾、造血系统等严重损害者(肝功能ALT和/或AST>正常上限值20%,肾功能BUN>正常上限值20%和/或Cr>正常上限值者)。

(4)妊娠或哺乳期妇女。

(5)法律规定的残疾患者(盲,聋,哑,智力障碍,精神障碍,肢体残疾)。

(6)怀疑或确有酒精、药物滥用病史。

(7)过敏体质(对2种以上食物或药物过敏者)。

(8)近1个月内参加过其他药物临床研究的患者。

3血浆样本收集及保存

经知情同意后,抽取研究对象空腹10小时或以上静脉血2ml,取血后,EDTA抗凝,3000rpm离心15min后收集血浆置于1.5mlEppendorf管中,放入-20℃冰箱保存,1周后转至-80℃冰箱保存。

4检测前样本处理

将保存的血浆自然解冻,用液体快速混合器混合30秒后转入高速离心机离心2分钟(10000转/分钟)。从原样本取20uL放入新标记的EP管内,再向新管加入甲醇180uL稀释十倍,用液体快速混合器混合30秒,再把混匀的液体放入离心机内离心5分钟(13200转/分钟),将离心好的液体移入检测瓶内100-150uL待测。

5 LC-MS/MS检测条件

5.1 LC-MS Q1全扫检测条件如下:

仪   器: API (喷雾离子源)  LC-MS/MS 3200

流动相 B: 10mM乙酸铵、0.10%甲酸        流动相C:乙腈

色谱 柱:Eclip XDB C18  46*150mm 5um Aglient  上样量:5ul

质谱参数:CUR:25.00  TEM:550.00  GS1:50.00  GS2:60.00 

ihe:ON    IS:-4500.00  DP:-50.00   EP:-10.00  

梯   度:表2

Retention(min)

Flow(ml/min)

B%

C%

0

0.75

90

10

0

0.75

90

10

1.5

0.75

90

30

7

0.75

72

80

12

0.75

10

95

15

0.75

5

95

15

0.75

90

10

20

0.75

90

10

5.2色谱-质谱条件

质谱 参 数:正离子扫描  扫描范围50-1000

CUR:20.00;  IS:5500.00;  TEM:580.00;GS1:55.0;

GS2:60.00;  CAD:Medium;DP:50.0;EP:10.0

液相参数:  流速:0.75ml/min;柱温:30;

流动 相 :   A:水     B:已腈

梯度:表3

Time(min)

A%

B%

0

90

10

0

90

10

1

70

30

5.5

20

80

8

5

95

15

5

95

15.1

90

10

20

90

10

6数据分析

质谱扫描图经MZmine处理后导入到SIMCA-P(version11.5,Umetrics AB,Umea,Sweden)软件中进行主成分分析(PCA)。运用偏最小二乘判别法(PLS-DA)对健康对照组、UA组进行分析,两组比较采用T检验。

结  果

(1)各组血浆代谢产物的典型色谱-质谱TIC图

本研究应用LC-MS/MS进行分离检测,使用正离子模式,测定血浆中小分子的代谢产物。各组血浆的典型色谱-质谱图如下:

TIC.jpg

图1经过Q1全扫后典型LC-MS/MS总体扫描图

tic 1-10.jpg

图2健康组对照组(TIC 1-10)LC-MS/MS的TIC离子扫描图

                           

tic r1-r10.jpg

图3UA组(TIC R 1-10)LC-MS/MS的TIC离子扫描图

(2)MZmine处理

将Q1扫描得到的总离子流图经在MZmine软件上进行数据格式转换按照导入、图谱查看、对比、去噪音 、质谱峰提取、反卷积处理、峰排列、对齐、合并、峰合并后开始列表去噪音、缝隙填补处理,对数据进行标准化预处理,最后将数据以CSV、XML格式导出,并导入EXCEL表中,供分析使用具体数据举例如下表:

表4

row ID

m/z

rt

m/z-rt

样本1

样本2

1

80.3

10.686

80.32-10.68

积分

积分

图4为质谱峰提取、去噪、合并后的截图,去噪音的效果,并没有太大的改变出峰的情况,但是将响应值降低了一半,有利于数据分析。

图4(质谱峰提取、去噪、合并)

(3)代谢物主成分分析(PCA分析)

将MZmine处理过的数据导入软件SIMCA-P11.5后,建立工程,制定工作集,健康对照组用D表示、试验组入组用M表示、试验组出组用G表示,指定PCA模型进行拟合软件提供多种图示,如下图为t[comp.1]/t[2comp.]椭圆图、样本点在空间中与模型的距离图等。

图5 D/M两组血浆PCA主成分分析距离图

两组分值主要集中分布于椭圆形散点图(95%置信区内)的区域,各组之间无明显交叉和重叠。PCA主成份分析涵盖了所有Q1的数据从Q1数据这个层面上看健康对照组、UA组基本上组内都聚集在一起,但UA组8、9、10偏向健康对照组。PCA分析发现两组样品之间的存在明显差异,并在大量数据中发现可能造成上述差异的具体指标。将找到的指标导出供下一步筛选。

找出差异指标截图如下图:

图11

5 通过ms/ms搜库,mzmine搜库可能潜在标志物列表如下

表6

MASS

(M/Z)

ID

VIP

RETENTIONTIME(min)

Peak height in

d VS m

NAME

330.46

11869

2.17

8.34

Dihydroceramide神经酰胺

466.45

7425

2.65

12.55

Glycocholic acid甘氨胆酸

377.44

5

2.03

12.50

Allolithocholic acid别石胆酸

7970

6,7-dihydro-12-epi-LTB4

OR 10,11-dihydro-leukotriene B4白三烯B4

研究二  陈旧性心肌梗死患者血浆代谢组学研究

材料与方法

1.材料

1.1仪器

UPLC液相色谱仪(四元梯度粟-在线真空脱气机-自动进样器-二极管阵列检测器-柱温箱)(美国,Waters公司)

飞行时间质谱仪(电喷雾离子源-正、负离子扫描方法-Lockspray)(美国,Waters公司)

KDC-160HR高速冷冻离心机(中国,科大创新股份有限中佳分公司)

漩祸混合器(中国,其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.2药品与试剂

乙腈,色谱级(美国,Fisher公司)

屈臣氏蒸馆水(中国,屈臣氏公司)

甲酸,色谱级(美国,KIKMA公司)

亮氨酸脑啡肽(美国,SIGMA公司)

甲醇,色谱级(美国,KIKMA公司)

异丙醇,分析级(中国,天津博迪化工有限公司)

氢氧化钠,分析级(中国,天津市化学制剂六厂)药品。

2.方法

2.1病例采集同研究一

2.2血液样本的采集及处理:所有观察对象均在所科观察对象均在上午8时前空腹抽取射静脉血5ml,经3000r/min,速度离心lOmin,封口,放置于-20C低温冰箱内保存。于测定前取出,放至完全溶解后,取上清1. 5ml待测。精密吸取200 U L血清置于具塞离心管中,加入甲醇,震荡30秒后,4°C、13000rpin离心15分钟,取上清液置于Waters进样小瓶中,备UPLC-MS分析。

2. 3 UPLC-TOF/MS 分析

色谱条件:ACQUITY UPLC'" BEH Ci8 色谱柱2. 1 X50mm);流动相:A:0. 1%甲酸乙腈,流动相B:0.1%甲酸水,梯度洗脱程序如表-1所示;流速:0.4ml/min;柱温:45°C。自动进样器温度4°C。进样量2uL。质谱条件:电喷雾离子(ESI)源,正离子(W + )模式采集,2500 V的毛细管电压,30 V的锥孔电压,温度350 °c脱溶剂气,温度的离子源,700 L/的脱溶剂气流量,30 L/h的锥孔气流量;0-12 min的釆集时间,扫描范围m/z 50-1000 Da,每次扫描0.2 s,两次扫描间隔0.02 s;亮氨酸-脑啡肽溶液为锁定质量溶液实时校正精确质量。

2.4 数据分析

血清样品处理后经UPLC-TOF/MS分析,采集UPLC-TOF/MS初始结果RAW文件,经Marker 1 ynx软件(美国,Waters)进行色谱峰自动识别和峰匹配,生成念保留时间、质荷比及响应强度信息的代谢物列表。将该矩阵列表导入EZi nfo (Umetr i CS,Umea, Sweden)进行主成分分析(PCA)及偏最小二乘判别分析(PLS-DA )、JF-:交校JH的偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA),并从输出的贡献值(V[P)列表中选择VIP值大于1的离子,进而采用t检验考察所选离子在组间差异的显著性,潜在的生物标志物以差异显著者为准。

3.结  果

3.1代谢指纹谱的基峰离子流

质谱条件优化,主要考察了毛细管电压、脱溶剂气流量、温度等因素。最终确定了分析条件,所得各组样品的典型代谢指纹谱的基峰离子流(base peak intensity, BPI)图见图 1

图1两组血清样品的典型代谢指纹谱的基峰离子流图

3.2潜在标志物

表1 发现的潜在标志物

研究三室性早搏患者尿液代谢组学研究

1.   资料与方法与研究二相同

2.   结  果

2.1所得各组样品的典型代谢指纹谱的基峰离子流(base peak intensity,BPI)图见图 1。

图1正离子电离模式下各组尿液样品的典型代谢指纹谱的基峰离子流图

3.  

2.2受试药物调节的潜在生物标志物

为挖掘潜在生物标志物,本研究将正常组和室性早搏组应用有监督的模式识别方法OPLS-DA进行组间判别分析,得出潜在生物标志物。见图2和表1.

图2 经OPLS-DA分析的VIP图,

表1潜在生物标志物

讨   论

研究发现在UA患者血浆中有异常升高的白三烯B4,在动脉粥样硬化的发展过程中LTB4促进单核细胞向泡沫细胞的转化,在初期的人类单核细胞强烈诱导MCP-l的表达并与MCP-1相互作用。这一结果再次例证了在UA患者冠状动脉内皮存在炎症反应,最终形成动脉粥样斑块不稳定或引发冠状动脉痉挛,导致心绞痛反复发作。5-LO是脂氧酶家族成员,是催化花生四烯酸转化成白三烯(1eukot-Riene,LTs)的关键酶。本研究通过液质联用技术检测出不稳定型心绞痛患者血浆中有高表达的白三烯,推测不稳定型心绞痛患者可能存在5-脂氧化酶(5-LO)代谢通路的建立。研究还发现不稳定型心绞痛患者以及心肌梗死的血浆中有远高于健康人的甘氨胆酸、别胆酸、石胆酸推测不稳定型心绞痛患者代谢转化及脂蛋白分泌的脂酸超过肝脏摄取的能力,这有可能导致肝细胞功能受损,合成胆汁酸能力下降,胆汁酸池体积缩小。为了维持其正常的胆汁酸肠肝循环,必须增加肠肝循环的次数,造成胆汁酸的丢失。同时由于肝细胞功能受损,使胆汁酸经肝血窦进入血液内的胆汁酸量增加;随着肠肝循环的增加,又使进入血液中的胆汁酸增多。由此可推断不稳定型心绞痛患者存在脂质代谢障碍。

本研究发现UA组患者的血浆中含有明显高于健康组浓度的神经酰胺,在不稳定型心绞痛患者体内神经酰胺应激激活蛋白激酶和Jun氨基端激酶途径,活化白细胞介素-1转换酶相关蛋白酶而启动Fas系统。Fas系统通过调节动脉粥样斑块中血管平滑肌细胞(VSMC)的凋亡过程、抑制T淋巴细胞凋亡造成T淋巴细胞本身长期、过度活化,加速平滑肌细胞的增殖和迁移,破坏斑块内细胞成分,使得斑块不稳定、心肌细胞凋亡而发生心绞痛。

    研究发现不稳定型心绞痛、陈旧性心肌梗死有着共同的代谢产物,而恰巧选择的中医证候类型也是同为心气不足型,这提示胸痹心气不足证的本质有可能与这三种代谢产物的代谢机理严密相关。而同为心气不足证的心悸则没有找到与胸痹相同的代谢产物,分析原因有可能是因为样本量较少。


    2013/8/27 13:02:16     访问数:1715
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