C反应蛋白诱导外周血内皮祖细胞衰老及非诺贝特的保护作用

作者:何晋[1] 陈晓彬[2] 郑昭芬[1] 郭莹[1] 杜可[3] 
单位:湖南省人民医院[1]
中南大学湘雅医院[2]
湖南中医药大学药理教研室[3]

   非诺贝特(fenofibrate,FF)是第2 代苯氧芳酸类药物,为人工合成的过氧化体增殖物激活型受体α(peroxisome proliferate-activated receptor α, PPARα)的配体,属于氯贝特类调脂药物,临床上广泛用于治疗高脂血症。临床研究证明非诺贝特对心血管的保护作用除了调脂作用外,还可能与其非调脂作用密切相关。非诺贝特能激活PPARα起到抗氧化和抗炎症的作用,从而保护内皮功能 。本实验旨在通过体外C 反应蛋白(C- reactive protein,CRP)和非诺贝特干预外周血内皮祖细胞( endothelial progenitor cells, EPCs),观察其数量和功能的变化,并探讨其作用机制。

1材料与方法

1.1材料

   非诺贝特及C 反应蛋白购于美国Sigma 公司;淋巴细胞分离液Ficoll-paque 购于天津灏洋生物公司。RPMI-1640 培养液购于广州Invitrogen 公司。胎牛血清购于Hyclone 公司。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) 购于R&D公司。碱性成纤维细胞生长因子( basic fibroblastgrowth factor, bFGF)购于Peprotech 公司。人纤维连接蛋白购于美国Chemicon 公司。DiI 标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acetylated low density lipoprotein,DiI-acLDL)购于美国Molecular Probes 公司。CRP、羟乙基淀粉( HES)、FITC 标记荆豆凝集素I( FITC-UEA-I)、SA-β-半乳糖苷酶染色试剂盒购于上海碧云天公司, RevertAidTM First Strand cDNA SynthesisKit 购于美国Fermentas 公司,2 ×聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR) Master Mix( 由TaqDNA 聚合酶、PCR buffer、MgCl2、dNTP 组成) 购于美国Fermentas 公司,100 bp DNA Marker 及TRIZOL购于晶美公司,鼠抗人内皮型一氧化氮合酶( endo-thelial nitric oxide synthase, eNOS)单克隆抗体、免疫印迹杂交法(Western blotting) 试剂盒(含有HRP 标记的Ⅱ抗)购自R&D 公司,DAB 试剂盒购自博士德公司。

1.2实验分组

  随机将6 孔板贴壁细胞分组,在CRP 诱导后观察非诺贝特对EPCs 数量、增殖、趋化能力、细胞存活能力的作用及对NO 水平的影响,分组如下: ①对照组:含10% 胎牛血清的RPMI-1640 培养基; ②CRP 组:1 mg/ L、2.5 mg/ L、5 mg/ L CRP; ③CRP + 非诺贝特组:加入10 mol/ L 非诺贝特培养4 h 后,再加入CRP 5 mg/ L; ④非诺贝特组:加入10 µmol/ L非诺贝特到含10% 胎牛血清的RPMI-1640 培养基中。非诺贝特溶于二甲基亚砜( dimathyl sulfoxide, DMSO) 溶液中,DMSO 终浓度≤0.01%。每组设3个复孔(n =3),实验重复3 次。

1.3 SA-β-半乳糖苷酶染色

   单个核细胞培养4 天后,在12 孔培养板加入不同浓度的CRP 干预,或预先加入非诺贝特作用4 h,再加入5 mg/ L CRP,继续培养7 天后进行SA-β-半乳糖苷酶染色。

1.4逆转录多聚酶链反应

   Trizol 试剂提取细胞总RNA,氯仿抽提,异丙醇、乙醇沉淀洗涤后,用焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocar-bonate, DEPC)处理过的水溶解RNA。使用核酸蛋白测定仪鉴定RNA 纯度和量,所用RNA 的A260/ A280均在1.8 ~2.0 之间,用M-MLV 逆转录酶(MBI 公司)将提出的RNA 逆转录为cDNA,以cDNA 为模板进行PCR 扩增反应。引物通过斯坦福大学在线引物设计软件设计,人端粒酶逆转录酶(human telomerase re-verse transcriptase, hTERT ) 引物序列上游5ˊ- CGAGACCAAGCACTTCCTCT-3ˊ, 下游5ˊ-TTC-CCCAGGGAGATGAACTT-3ˊ,引物全长523 bp;内参磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH) 上游5ˊ-AATCCCATCACCATCTTC-CA-3ˊ, 下游5ˊ-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3ˊ, 产物全长587 bp。PCR 反应条件:95℃预变性1 min;95℃变性30 s;60℃退火30 s;68℃延伸1.5 min;68℃终末延伸10 min。实验分组同上。PCR 结果的琼脂糖凝胶电泳照片采用TIPAS 98 图像分析仪进行灰度扫描,测定产物条带的积分光密度(integral optical density, IOD),目的片段的相对表达强度用目的片段(IOD) / GAPDH(IOD)的相对比值表示。

1.5  Western blotting 分析

   按分组提取30 µg 的细胞蛋白抽提液,以体积分数为10%的十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。待电泳完毕后用Bio-Rad 公司的半干电转移槽转移至硝酸纤维素膜上,在室温下用封闭缓冲液[5 g/ L 脱脂奶粉、0.3%Tween 20、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)]封闭1 h。分别再依次与鼠抗人eNOS 单克隆抗体、Ⅱ抗(酶标HRP 抗体)反应后,增强化学发光法显色,X 线底片曝光显影。选择清晰的X 片在Image- tool 图像分析系统中进行吸光度分析。

1.6统计学处理

   采用SPSS 13.0 统计软件进行分析,所有数据用

±s 表示,组间比较用单因素方差分析,P <0.05认为差异有统计学意义。

2结果

2.1内皮祖细胞的鉴定

   分离获得的单个核细胞培养7 天的过程中,细胞由单个的小圆形变成一个个细胞集落,集落中心为圆形细胞,周围为呈放射状分布的梭形细胞(图1)。用DiI-acLDL 及FITC-UEA-I 对细胞染色后,通过荧光显微镜对细胞进行观察,DiI-acLDL 摄取后细胞呈红色,FITC-UEA-I 染色后细胞呈绿色,双染色的细胞为正在分化的EPCs,呈黄色,98% 以上的细胞为双染色阳性细胞(图2)。

2.2   C 反应蛋白加速内皮祖细胞的衰老及加入非诺贝特后的变化

   细胞内β-半乳糖苷酶在酸性条件下稳定表达是细胞衰老的分子特征,我们采用识别和探测衰老细胞的通用技术方法SA-β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测衰老细胞(图3)。随着EPC 培养时间的延长,SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞明显增加。不同浓度的CRP 与EPC 培养后,CRP 增加SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞数量,SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞数量随着CRP 浓度的增加而增加,5 mg/ L CRP 能显著增加衰老细胞的数量,较对照组增加2 倍(60.4 ±7.6 比20.1±9.2,P <0.01)。在加入非诺贝特10 µmol/ L后能减少CRP 诱导的衰老细胞数量(40.8 比60.4±7.6,P <0.01;图4)。

2.3非诺贝特对C 反应蛋白诱导的内皮祖细胞人端粒酶逆转录酶表达的影响

   加入1.0、2.5、5.0 mg/ L CRP 刺激EPCs 24 h, RT-PCR 结果显示,CRP 作用EPCs 后hTERT mRNA表达随着CRP 作用浓度的增加而减弱,其灰度比值分别为0.69 ±0.05、0.54 ±0.03、0.30 ±0.04,与对照组比较,差异有显著性(P <0.01,图5),加入非诺贝特10 µmol/ L 后可以显著逆转CRP 诱导的hTERT mRNA 表达下调, 其灰度比值为0.62 ±0.01、0.90 ±0.03,与CRP 5 mg/ L 组比较,差异有显著性(P <0.05 及P <0.01;图6)。

2.4非诺贝特对C 反应蛋白诱导的内皮祖细胞内皮型一氧化氮合酶表达的影响

   Western blotting 结果显示,与对照组比较,CRP5 mg/ L 组能显著抑制eNOS 蛋白表达,其灰度比值(0.29 ±0.02)与对照组(0.86 ±0.02)比较,差异有显著性(P <0.01,但在加入非诺贝特10 µmol/ L 后能显著上调eNOS 蛋白表达(0.62 ±0.03、0.98 ±0.031 比CRP 组的0.29 ±0.02,P <0.01)(图7)。

3讨论

   在前面的研究中,我们初步研究了CRP 对体外培养的内皮祖细胞的数量及功能的影响,在本实验中我们观察到CRP 能加速EPCs 的衰老,Assmus等报道EPCs 衰老跟EPCs 数量减少和功能损害有关。近来的研究表明高血糖以及雷帕霉素通过加速EPCs 老化而导致EPCs 功能损害。而雌激素则可以延缓EPC 衰老并改善其功能。根据这些研究结果,我们推测细胞衰老与炎症因子CRP 抑制EPCs CFU 生成、减少EPCs 数量、损害其功能有关。研究者认为高水平的CRP 加速EPCs 衰老可能跟端粒酶活性有关,在细胞分子水平上,染色体末端端粒的损耗是衰老的重要机制,染色体端粒丢失最终可造成细胞衰老直至凋亡。端粒的维持是通过端粒酶完成的。端粒酶是一种特殊的核糖核蛋白逆转录酶,能以自身RNA 为模板合成端粒DNA 并添加到染色体末端,延长真核细胞染色体端粒。端粒酶是一种依赖于RNA 的DNA 多聚酶,具有逆转录酶的活性,活化后能以自身RNA 为模板,逆转录合成端粒重复序列,从而弥补细胞分裂中端粒片段的丢失。同样在本研究中观察到CRP 能加速EPCs

的衰老。

   但是,CRP 降低EPCs 抑制hTERT 活性的机制有待进一步明确。在本研究中,我们观察到CRP 显著抑制EPCs 的eNOS 蛋白表达。eNOS 是产生NO重要的酶,而NO 被证实可激活端粒酶逆转录酶,从而活化端粒酶,延缓内皮细胞衰老。但是,NO 供体,S-nitrosopenicillamine (SNAP)并不能预防EPCs的衰老,提示EPCs 衰老的调节跟NO 无关。因此,我们推测CRP 减少EPCs 的eNOS 表达, 引起hTERT 的逆转录下调,从而使端粒酶活性下降,最后导致EPCs 衰老的加速。

   非诺贝特是第2 代苯氧芳酸类药物,在临床上广泛用于治疗高脂血症,近年来研究的热点主要围绕在其非调脂作用。在我们的系列研究中发现非诺贝特能通过干预溶血卵磷脂诱导的内皮细胞凋亡,使内皮细胞增殖增强,减弱凋亡。我们发现非诺贝特能通过上调eNOS 蛋白表达,激活hTERT,预防CRP 诱导的细胞衰老。


    2013/6/15 16:01:42     访问数:1242
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