基因分型指导华法林使用剂量

   华法林是目前广泛应用的香豆素类口服抗凝药,在临床上广泛使用已超过60年,其主要用于预防和治疗血栓栓塞性疾病,如人工瓣膜置换、静脉血栓形成(肺栓塞)、房颤等的口服抗凝治疗,以及降低心肌梗死复发及心肌梗死后血栓栓塞死亡的危险。新近大规模的流行病学临床试验已证实其在静脉血栓症的一级、二级预防,人工瓣膜置换和房颤全身栓塞的预防,急性心梗后全身栓塞预防和辅助治疗,以及再发心梗风险中的显著获益。但是华法林的剂量很难掌握,因为不同病人的所需用量可以相差十倍以上,如果服用过量则可出现致命性出血,但剂量过低则有血栓风险,因此选择适宜的起始剂量十分重要。目前,临床上多通过监测凝血酶原时间,依据国际标准化比值(INR)对患者进行个体化用药指导,维持适宜的剂量,以达到理想的治疗效果。临床上维持华法林的治疗水平需要医师深入了解华法林的药代动力学和药效动力学,药物基因组学、药物相互作用以及饮食影响。
   个体对药物的不同反应主要源于外界环境因素改变和机体本身的遗传变异,其中药物代谢关键通路的遗传因素往往起决定作用。药物基因组学可以帮助人们更好地认识药物与机体之间的相互作用,根据个体遗传差异来选择药物及其剂量,从而实现个性化以增加疗效减少不良反应。近年来随着华法林药物基因组学的不断发展,在很大程度上解释了华法林的个体差异和种族差异,并且已经将华法林剂量与遗传变异相关性的研究成果成功应用于临床来指导临床实践。本文将着重从药物基因组学的角度系统阐明如何利用基因检测指导华法林临床用药。
   1.华法林的抗凝机制
   华法林主要可以抑制维生素K参与的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ在肝脏的合成。对血液中已有的凝血因子 Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ并无抵抗作用。人体内肝脏合成的凝血因子II、VII、IX、X,需要经过维生素K依赖性羧化酶(γ—谷氨酸基羧化酶)的羧化作用才能成为有活性的凝血因子,羧化过程还需要还原型维生素K(VK)、分子氧和二氧化碳。华法林为口服的维生素K拮抗剂(VKA),通过抑制肝脏环氧化还原酶,使无活性的氧化型(环氧化物型)VK无法还原为有活性的还原型(氢醌型)VK,阻止VK的循环应用,干扰VK依赖性凝血因子II、VII、IX、X的羧化,使这些凝血因子无法活化,仅停留在前体阶段(有抗原,无活性),而达到抗凝的目的。并且这类蛋白与氧化失活的维生素K结合,进一步阻碍维生素K环氧化物由环氧型向氢醌型转变。另外,华法林通过抑制凝血因子的活化抑制新的血栓形成,限制血栓的扩大和延展,抑制在血栓的基础上形成新的血栓,抑制血栓脱落和栓塞的发生,有利于已经形成血栓的清除。
   华法林尚能抑制具有抗凝作用的蛋白C和蛋白S的羧化作用,因此理论上华法林有致凝的可能性,但在多数情况下,华法林抗凝的作用占优势。
   2.华法林的体内代谢
   华法林的化学结构为3-(a-苯基丙酮)-4-羟基香豆素,是消旋异构体R和S的混合物,分子式为C19H15NaO4。华法林是由S-华法林和 R-华法林组成的消旋体,主要在肝脏中被不同的细胞色素氧化酶(cytochrome P450, CYP)同工酶通过羧基化而代谢成非活性产物。目前已证实在人的肝脏,抗凝作用更强的S-华法林对映体85%以上经由CYP2C9代谢转化为无活性的6-羟化产物和7-羟化产物,另外CYP2C18、CYPlCl9和CYP2A6也参与S-华法林的代谢。而代谢R-华法林的同工酶主要有CYP3A4、CYPlA2、CYPlAl和CYP2C19。上述几种 CYP均具有基因多态性,其中CYP3A4、CYP2C19 、CYP1A2多态性对华法林的剂量及抗凝作用影响较小,而CYP2C9多态性对华法林的代谢、剂量及抗凝作用的影响最重要。
   3.华法林的药理基因组学
   目前已被证实有30多种基因相互作用决定华法林的代谢、转运和药理作用。患者不同的药物基因组学信息是导致华法林剂量差异的重要因素。因此在许多情况下,基因型是决定华法林达到最佳抗凝效果的关键变量。由遗传因素导致低华法林剂量的患者最常见的原因是由CYP2C9代谢活性降低和药物靶标 VKORC1低表达引起的。这两种基因的遗传多态性在全世界范围内可解释约15%和25%的华法林剂量变异。
   华法林主要是经细胞色素P450酶(cytochrolne P450,CYP)代谢, CYP450(cytochrome P450)是一组涉及到许多内外源性物质代谢的单加氧酶,位于细胞内质网膜上的CYP450蛋白由CYP基因超家族编码。作为CYP450家族中的重要成员CYP2C9,是人类肝脏中最重要的药物代谢酶之一。而S-华法林在体内85%以上是由CYP2C9代谢转化为无活性的6-和7-羟化物。CYP2C9基因位于10q24.2,约50kb。其野生型等位基因CYP2C9*1,在不同的种族中的频率变异在80%到95%之间。在CYP2C9与华法林剂量相关性的研究中,CYP2C9*2 (C430T,rs1799853)和 *3 (A1075C,rs1057910)为研究较多的2个位点,这两种变异型的代谢能力较普通型下降约30%。Higashi等首次报道了CYP2C9基因分型和抗凝或出血之间的关联。其后, Sanderson等系统地研究表明CYP2C9*2或CYP2C9*3变异降低华法林的剂量, CYP2C9*3变异体的降幅更大( 减少 30%)。而且Gage等发现,携带 CYP2C9*2或 CYP2C9*3变异型的患者华法林代谢慢于携带野生型的患者,传统的剂量易导致出血反应。CYP2C9*2和CYP2C9*3的基因频率在不同人种和不同民族之间差异很大。在高加索人群中这两点的等位基因频率约为15%和30%。而国人的研究显示等位基因频率远远低于白种人的频率。并且CYP2C9*2基因型在国人中并不存在,在周宏灏等一项对照研究中CYP2C9*3等位基因频率为0.049,大大低于白种人的频率。
   VKORC1基因位于染色体16p11.2,约4.5kb,编码维生素K依赖性凝血因子生成的限速酶, 而维生素K环氧化物还原酶(VKORC)是华法林作用的靶点。多项研究均表明VKORC1多态性能显著影响华法林的使用剂量。Yuan等首次发现VKORC1启动子的多态性(-1639G>A),在11例华法林敏感的患者中( ≤1.5mg/d)全为AA基因型,在华法林耐药的5个患者中或者为 AG型或为GG型,在 104个随机选择的患者中AA(n= 83)基因型所需的剂量[ ( 2.61±1.10)mg/d]也低于AG或 GG基因(n=21)[(3.81±1.24) mg/d]。因此GG和AG基因型与AA基因型相比,其启动子活性高,VKORCl mRNA表达增加,VKORCl蛋白也相应增加,引起VKORC活性增高,从而凝血因子生成较多。由于VKORCl是华法林作用靶点,所以所有华法林敏感者全是基因型为AA的纯合子,而华法林抵抗的个体其基因型为AG或GG。Veenstra等。研究结果也提示VKORCl的变异可解释31%的维持剂量差异,而CYP2C9仅解释了7.9%的差异,该研究指出香港华人中VKORCl基因多态性是个体间华法林维持剂量差异的决定因素,而华人AA基因型频率比欧洲人高也可能是华人华法林维持剂量比欧洲低的主要原因。
   新近的全基因组关联分析表明CYP4F2也是决定华法林剂量的一个重要遗传因素,它可解释约2%的个体差异。CYP4F2基因位于染色体19p13.12,约20kb,为维生素K的单氧酶,可氧化底物生成ω—羟基衍生物。主要通过不同基因型影响人肝微粒维生素K代谢活性改变患者对华法林的需要剂量。其中,CYP4F2基因的错义突变V233M(rs2108622)TT基因型患者的剂量比CC基因型患者每天多1mg的剂量。
   最近针对国人的一项研究报告中发现除CYP2C9,VKORC1和CYP4F2 3个主要基因外,影响华法林剂量的还有CYP2C18,PROC和EPHX1,多元回归分析后可解释约3%的个体差异。但是,尽管如此,将上述多态性位点纳入各种华法林基因剂量预测模型,仍然有30%~40%的变异不能完全解释。说明了其他基因的遗传多态性或相关临床因素存在的可能性。
   4. 环境因素和药物相互作用对华法林抗凝疗效的影响
   华法林使用的个体差异还与环境因素如:种族、年龄、身高、体重、饮食、吸烟、有无肝疾病等以及临床上药物间的相互作用显著相关。上述各影响因素对华法林剂量影响比例分别为:VKORC1约25%,CYP2C19 约15%,年龄、身高、体重 10%-20%,药物之间相互作用5%-10%,其它因素30%-40%。
   华法林是由S-华法林和 R-华法林组成的消旋体,主要在肝脏中被不同的细胞色素氧化酶同工酶代谢成非活性产物,其中抑制S-华法林代谢活性是R-华法林的5倍而更加具有临床意义。因此,抑制S-华法林代谢失活的药物能显著增强华法林的抗凝效果,如:胺碘酮、保泰松、甲硝唑、磺胺、磺吡酮、大环内酯类抗生素、别嘌醇,单胺氧化酶抑制剂(如苯乙肼,苯丙胺等),西咪替丁,三环类抗抑郁药(如丙咪嗪,氯丙咪嗪等)等。另外,一些中药如人参和西洋参的主要活性成分都是多种人参皂苷,可以诱导肝酶对华法林代谢增强从而降低其抗凝活性。相反,那些加速华法林经肝脏清除的药物则能抑制其抗凝疗效,如:苯巴比妥、卡马西平、利福平、硫唑嘌呤、格鲁米特、灰黄霉素等。
   华法林是一种维生素K的拮抗剂,减少体维生素K体内水平能显著增强其抗凝活性,如清除肠道细菌使内源性维生素K生成减少的药物:磺胺、几种广谱抗生素;如影响维生素K吸收的药物:液状石蜡,考来烯胺等。相反,含有大量维生素K的食品能降低华法林抗凝效果,如:绿茶。另外,长期服用华法林患者对饮食中的维生素K的变化敏感从而影响INR的稳定性,含有叶绿醌的植物中作为维生素K的主要来源,通过影响其摄入而影响华法林抗凝效果。
   药物还可通过影响抑制维生素K依赖的凝血因子的合成与清除、或干扰其它止血途径来影响华法林的抗凝效果。那些通过抑制维生素K循环转化而增强华法林抗凝疗效的药物,如:二、三代头孢;增加凝血因子代谢增强法林抗凝疗效的药物,如:甲状腺素。肝功能不全时,可通过维生素K依赖凝血因子减少,增加华法林的抗凝效果。
   临床上抑制血小板功能的药物与华法林联用将增加华法林出血风险,如:阿司匹林、非甾体抗炎药物、大剂量青霉素、拉氧头孢等。
   因此,正在口服华法林的患者,要特别注意增加任何药物、中草药,或改变饮食习惯对华法林代谢的影响,加强对INR的监测。 
   5. 基因分型指导临床个体化用实施
   以往临床上华法林的给药方案通常采用首先给予标准剂量,然后临床医生根据每个患者INR 值的情况,增加或减少剂量直至INR达到靶标范围内。由于华法林的临床个体用药量差异是由多种因素决定的,美国FDA在2007年修改了华法林的使用标签,建议在使用华法林前进行基因分型,以警示医生及患者个体的遗传差异可能影响其对药物的反应,但是并没有提供一个使用遗传因素预测华法林个体治疗剂量的可操作性的方法。
   近年来随着药物基因组学的不断深入,依赖于药理遗传学的结果而建立起来的华法林维持剂量的模型也不断的出现,由国际华法林遗传药理学协会报道的一项研究显示,在使用5052例国际标准化比值在2到3之间的用于本研究的数据而建立起来的华法林遗传药理法则,在获得患者的基因型后再根据相应临床资料能精确地计算出该患者所需要的华法林剂量。美国Mayo Clinic临床医学中心的研究表明,与既往服用华法林未进行基因测试队列相比,服用华法林前对患者进行基因检测,其用药后总体住院率下降31%,因出血或血栓的总体住院率减少28%。因此在开始应用华法林时对患者进行基因型检测可以降低不良事件的发生率,从而改善应用华法林的安全性和有效性。
   同济医院心血管实验室目前已经完成705例患者基因分型指导华法林剂量的调整。其中VKORC1基因分型中GG野生型患者12例,占1.7%,AA突变型患者576例,占81.7%,AG杂合型患者117例,占16.6%;CYP2C9*3基因分型中AA野生型例641,占90.92%,CC突变型1例,占0.14%,AC杂合型63例,占8.94%。上述分型结果提示:仅考虑遗传因素对华法林剂量的影响,有近25%患者不服用标准华法林剂量。其中有1.7%的患者需要极高剂量,常规标准剂量容易造成血栓形成,而8%的患者需要较低华法林剂量,常规标准剂量有出血风险。如病例1,中年男性患者主动脉瓣置换术后2年,每天口服华法林1/4片抗凝,近期因血尿,怀疑膀胱肿瘤收入院,经手术证实是泌尿系血肿,后查INR 8.0,予以维生素K静滴后,血尿明显好转。最后经基因检测证实其携带为非常罕见的CYP2C9基因纯合子突变CYP2C9 *3/ *3型,导致华法林不能被快速代谢。后经过多次调整后华发林剂量为每天1/8片。又如病例2,一位年轻女性患者二尖瓣置换术后8年,长期口服华法林增至2片/日,INR仍不能达标,因担心出血风险长期未予以增加华发林剂量,后因腹痛,行腹部CTA发现:肾静脉血栓形成、肠系膜上动脉部分血栓形成。最后基因检测结果提示患者VKORC1GG野生型,为高剂量组,模型计算每天口服剂量应改为3片/日。后经过多次监测INR后每天服用3片后达标。因此,我们的临床实践证明,通过基因分型按照药理遗传学模型能非常准确有效地指导临床华法林应用,可大大减少INR的检查和降低由于用量问题(过量或不足)带来的风险。
   然而,在临床实践中仍然有20%的个体不能够准确预测,提示与华发林使用剂量相关的其它基因仍然有待进一步发掘。而那些非遗传因素,如禁食、长期使用抗生素、药物之间相互作用、饮食习惯变化、合并肿瘤等对华法林使用剂量也有着显著的影响。通过基因分型指导华法林使用剂量,虽能明显区分高、低剂量组,但其它非遗传因素也应是华法林临床使用中需要考虑的因素,INR比值仍然是临床实践中的金标准。随着研究的深入和不断改进及药物治疗模式的改变,临床上采取以药物遗传学为基础实行华法林个体化治疗的时刻已经来临。而在美国CYP2C9、VKORC1基因多态性分析已经成为临床实验室的重要检测项目,临床实验室已经成为指导华法林个体化治疗的重要部门。

    2013/4/26 10:33:44     访问数:2174
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