BALB/c和昆明小鼠对脓毒症盲肠结扎穿孔模型的比较

   摘要 目的 比较应用BALB/c和昆明(KM)小鼠建立脓毒症盲肠结扎穿孔(Cecal Ligation and Puncture,CLP)模型的区别。 方法 BALB/c和昆明小鼠各30只,分别建立假手术组和CLP模型组,术后6h进行血常规、生化检测、病理切片检查,术后72h比较两种品系小鼠盲肠结扎模型的生存率。结果 术后72h两品系小鼠假手术组存活率均为100%,CLP组BALB/c小鼠存活率为40%,KM小鼠存活率为60%,BALB/c小鼠72h生存能力低于KM小鼠(P<0.05)。与各自品系的假手术组相比,BALB/c小鼠和KM小鼠在术后6 h白细胞上升,血小板下降,谷丙转氨酶、谷草转氨酶升高(p<0.05),肺损伤明显,而红细胞、尿素氮和肌酐无明显差异。结论 BALB/c小鼠较KM小鼠对脓毒症盲肠结扎模型的敏感度更高。
   脓毒症是指机体被存在于血液或组织中的各种致病微生物感染所致的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome),是严重创伤、烧伤、感染、大手术后常见的并发症[1]。CLP模型则是目前用于研究脓毒症及脓毒症休克最广泛的一种模型。其原理是腹腔内感染形成腹膜炎,多重病原体感染导致SIRS、脓毒症、脓毒症休克甚至死亡[2]。CLP模型不仅易于标准化,还可以引入多种不同变量,可以模仿人类脓毒症中不同阶段血液动力学及代谢的变化,为建立临床模型提供参考。
   但是CLP模型也受众多影响因素的制约,动物品系即是其中重要影响因素之一。近交系BALB/c小鼠和远交系昆明小鼠都是我国常用的实验动物,其品系本身就是CLP模型的重要影响因素,但两者在CLP模型上的具体区别尚未见报道,本研究即拟对此进行研究。
1 材料和方法
1.1实验动物及分组
SPF级BALB/c雄性小鼠30只,8周龄,质量18~24g,SPF级KM雄性小鼠30只,8周龄,质量19~25g,由第二军医大学实验动物中心提供。动物适应性饲养1周后,将BALB/c小鼠与KM小鼠分别随机分成假手术组(简称Sham组)和脓毒症组(简称CLP组)。分组情况具体如下:(1)用于生存率分析的共40只:BALB/c Sham组10只,BALB/c CLP组10只,KM Sham组10只,KM CLP组10只;(2)用于血常规和血生化检测的共20只:BALB/c Sham组5只,BALB/c CLP组5只,KM Sham组5只,KM CLP组5只。
1.2主要试剂和仪器
   血液学检查采用Coulter-JT全自动检测仪(美国库尔特仪器公司生产);血液生化检测采用LDZ4-0.8型离心机,日立7020型全自动生化分析仪。
1.3实验方法
1.3.1建立脓毒症模型
   术前8小时禁食。CLP组常规消毒腹部,皮肤正中切开,打开腹腔寻找盲肠,小心分离其远端与大肠的系膜,避免碰伤肠系膜血管。盲肠内如有粪便,则轻轻将其挤向与其相连的结肠。在盲肠远端1/2处用无菌4号丝线紧紧结扎,并用无菌7号针头在已结扎盲肠远端中央处贯通穿刺,然后把盲肠推回腹腔,关闭腹腔,逐层缝合。假手术组分离盲肠末端后,不进行结扎穿孔,直接关闭腹腔,逐层缝合[3]。所有动物均在术后立即背部皮下注射生理盐水(50 ml/kg),行液体复苏治疗。整个实验过程在室温22~25℃环境进行,术后小鼠自由饮食饮水。
1.3.2血常规、血生化检测
   术后6h,每组各取5只小鼠,去眼球采血。采用Coulter-JT全自动检测仪,阻抗法测定:白细胞计数(WBC×109/L), 红细胞(×1012/L)和血小板计数(×109/L)。另取血离心收集上清,采用日立7020型全自动生化分析仪进行生化检测。检测指标:谷丙转氨酶(ALT,LDH-UV法)、谷草转氨酶(AST,MDH-UV法)、尿素氮(BUN,酶法)、肌酐(CR,酶法)。
1.3.3肺组织切片HE染色
   术后6h处死小鼠,取肺组织用10%甲醛固定24 h后,经洗涤、脱水、石蜡包埋、轮转式切片机切成4μm切片,分别进行HE染色,具体实验方法参考文献[4]。
1.4统计学处理
   采用SPSS18.0统计分析软件对数据进行统计分析。。计量资料以均数±标准差(x±s)表示应用生存分析中的Kaplan-Meier法比较四组小鼠存活率的差异;应用单因素方差分析LSD法分析四组小鼠之间的血常规和血生化之间的差异。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 BALB/c与KM小鼠术后72h存活率
   术后72h,Sham组BALB/c小鼠与KM小鼠均无死亡,存活率均为100%;CLP组BALB/c小鼠存活4只,死亡6只,存活率为40%;CLP组KM小鼠存活6只,死亡4只,存活率为60%。采用生存分析中的Kaplan-Meier法分析显示,CLP术后,BALB/c小鼠72h生存能力低于KM小鼠(P<0.05)。
图1 BALB/c与KM小鼠术后1周存活率
Fig1 survival rate of BALB/c and KM mice in 1 week after CLP
2.2 BALB/c与KM小鼠术后6 h外周血中血常规和生化值
   BALB/c小鼠术后6 h血常规及生化结果显示,同Sham组相比,CLP组BALB/c小鼠在术后6 h白细胞上升,血小板下降,谷丙转氨酶、谷草转氨酶升高(p<0.05),而红细胞、尿素氮和肌酐无明显差异(p>0.05)。KM小鼠术后6 h血常规及生化结果同样显示,同Sham组相比,CLP组KM小鼠在术后6 h白细胞上升,血小板下降,谷丙转氨酶、谷草转氨酶升高(p<0.05),而红细胞、尿素氮和肌酐无明显差异(p>0.05)。

表1 BALB/c与KM小鼠术后6h血常规和生化值(n=5)

Tab1 blood dection and chemistry analysis of BALB/c and KM mice in 6h after CLP (±s, n=5)

名称

BALB/c sham组

BALB/c CLP组

KM sham组

KM CLP 组

白细胞(×109/L)

4.82±0.82

7.17±1.24

3.16±0.87

6.96±1.12*

血小板(×109/L)

923±160.47 

726±117.82

871.11±125.36

736±98.32*

红细胞(×1012/L)

8.84±0.42 

8.12±0.63

8.19±0.76

7.98±0.83

谷丙转氨酶(U/L)

49.6±6.3

67±8.4

33.6±5.2

57±8.3*

谷草转氨酶(U/L)

152.4±21.6

189±27.3

126.3±19.5

192±23.7*

尿素氮(mmol/L)

 8.28±1.19  

8.86±1.78

8.58±1.02

9.01±2.12

肌酐(μmol/L)

19.8±2.7

20.1±3.1

11.6±3.5

12.3±3.6

vs BALB/c sham组,p<0.05; * vs Km sham组, p<0.05

2.3 肺组织切片HE染色
   肺组织病理结果显示,CLP术后6h KM小鼠出现肺泡塌陷,肺间质广泛炎性细胞浸润,少量纤维素形成(图2A)。CLP术后6h BALB/c小鼠肺泡塌陷较KM小鼠明显加重,红细胞渗出明显,少许肺实变,并有微血管血栓形成(图2B)。

A

图2 CLP术后6h BALB/c与KM小鼠肺组织病理改变(×400)
Fig2 Pathological change of lung tissue in 6hs after CLP in BALB/c and KM mice. (×400)

3 讨论
   CLP模型是用于研究脓毒症及脓毒症休克最广泛的一种模型,其方法是在盲肠近端处结扎,并用无菌针在已结扎盲肠远端贯通穿刺盲肠壁造成穿孔,粪便流入腹腔引起混合性细菌感染及坏死组织处炎症反应,动物模型很快出现典型脓毒症及脓毒症休克的表现[5]。CLP模型模仿临床上阑尾炎穿孔或憩室炎穿孔的特点,并一直被认作是脓毒症研究动物模型的“金标准”。但是根据既往报道,CLP模型即使在相同实验室条件、同种实验设备操作下,对比不同组数时病死率及死亡时间仍有很大差异。2008年,Rittirsch等发布CLP模型操作步骤以后,随着CLP模型的标准化和可靠性得到进一步提高,CLP模型也越来越规范[6]。但是CLP模型本身还受动物因素的影响,也是我们需要重视的。BALB/c和KM小鼠都是我国科研人员常用的实验动物,但是作为近交系的BALB/c小鼠 和远交系的KM小鼠,其品系就对CLP模型结果又很大影响。因此我们对BALB/c和KM小鼠在CLP模型的区别上加以研究。
   有报道显示,小鼠免疫系统组成的差异对小鼠抵抗外来病原的能力有重要影响[7]。本试验血常规和生化结果显示, BALB/c小鼠和KM小鼠在术后6 h较假手术组白细胞上升,血小板下降,谷丙转氨酶、谷草转氨酶升高(p<0.05),病理结果显示CLP术后6h小鼠出现急性肺损伤,证实术后6h BALB/c小鼠和KM小鼠均出现肺功能、肝功能损伤和凝血功能紊乱,而红细胞、尿素氮和肌酐无明显差异。脓毒症引起BALB/c小鼠和KM小鼠的多器官功能损害说明选用BALB/c小鼠和KM小鼠作为脓毒症CLP模型的试验动物均造模成功。同时,BALB/c小鼠CLP术后72h存活率为40%,KM小鼠术后72h存活率为60%,BALB/c小鼠对脓毒症CLP模型的存活率低于KM小鼠(P<0.05),同时病理结果显示BALB/c小鼠的急性肺损伤程度更重,这说明KM小鼠对脓毒症的耐受性更好。
   脓毒症动物模型必备的基本要素之一是动物模型有较高的自然死亡率[8]。因此,根据根据本研究结果,BALB/c小鼠死亡率更高,更适宜脓毒症造模。根据Rittirsch的CLP手术规范,结扎盲肠远端1/2为中度损伤,结扎盲肠远端3/4为重度损伤。本研究试验条件主要采用中度损伤,所以在重度损伤条件也可选择KM小鼠作为试验动物。
   总之,本课题通过研究BALB/c小鼠与KM小鼠对脓毒症CLP模型的反应,发现BALB/c小鼠与KM小鼠均可作为CLP模型的试验动物。两者相比,BALB/c小鼠对脓毒症反应更敏感,而KM小鼠对脓毒症具有一定的耐受性。


    2013/3/28 11:01:06     访问数:1646
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