盲肠结扎穿孔致小鼠弥漫性血管内凝血的试验研究

   目的 应用盲肠结扎穿孔术(CLP)建立小鼠弥漫性血管内凝血(DIC)动物模型。方法 将昆明小鼠随机分为假手术组(sham)、中度CLP组(mCLP)和重度CLP组(hCLP),检测术后即刻、2小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时共7个时间点的外周血血小板(PLT)计数、谷丙转氨酶(ALT)、肌酐(Cr)凝血酶原时间(PT)、部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、D-二聚体,计算72小时各组存活率,并进行组织病理切片观察。结果术后72h小鼠sham组存活率均为100%,mCLP组存活率为60%,hCLP组存活率为10%(P<0.05)。与sham组相比,mCLP和hCLP组小鼠CLP术后6小时PLT、FIB明显下降,APTT+PT延长,D二聚体、ALT升高,术后12小时Cr升高((P<0.05),组织病理显示肺和肠系膜出现不同程度的微血栓形成。 结论 CLP小鼠模型能够体现类似临床的DIC的发展过程,可作为DIC研究的动物模型。
   弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)是以不同原因所致的凝血因子和血小板被激活、继发性纤溶亢进,并引起广泛微血栓形成和出血为病理特征的获得性临床综合征,是临床一种常见病、多发病,是引起多器官功能衰竭的重要原因[1]。近年来,国内外曾试用多种外源性物质来制造DIC动物模型,如采用凝血酶、内毒素、高分子右旋糖酐、兔脑粉浸出液等,并得到广泛应用[2]。但这些模型使用外源性物质,与临床病理过程符合度不高。鼠类盲肠结扎穿孔模型(CLP)模仿临床上阑尾炎穿孔或憩室炎穿孔的特点,并一直被认作是脓毒症研究动物模型的“金标准”[3]。鉴于脓毒症是DIC形成的首要病因,CLP法也更为符合临床病理过程[4]。因此,本研究拟探讨用CLP法建立小鼠DIC模型,并用于对DIC病理生理过程的研究。
1材料和方法
1.1实验动物及分组
   SPF级昆明(KM)雄性小鼠135只,8周龄,质量18~24g、由第二军医大学实验动物中心提供。动物适应性饲养1周后,将KM小鼠分别随机分成假手术组(简称Sham组)、CLP中度损伤组(mCLP组)、CLP重度损伤组(hCLP组)。分组情况具体如下:(1)用于生存率分析的共30只:Sham组10只,mCLP组10只,hCLP组10只;(2)用于出凝血系列检测和病理分析的共105只:Sham组35只,mCLP组35只,hCLP组35只,按术后即刻、2小时、6小时、12小时、24小时、48h、72小时7个时间点取血标本。
1.2主要试剂和仪器
   Coulter-JT全自动检测仪(美国库尔特仪器公司生产),全自动凝血分析仪(法国STA-Compact公司),7020型全自动生化分析仪(日本日立公司),DENLEY DRAGON酶标仪(芬兰Thermo公司),TGL-168离心机(上海安亭科学仪器厂),LEICA RM2135轮转式切片机(德国LEICA公司)。
1.3实验方法
1.3.1建立小鼠CLP模型
   术前8小时禁食。CLP组常规消毒腹部,皮肤正中切开,打开腹腔寻找盲肠,小心分离其远端与大肠的系膜,避免碰伤肠系膜血管。盲肠内如有粪便,则轻轻将其挤向与其相连的结肠。mCLP组用无菌4号丝线紧紧结扎盲肠远端1/2处,hCLP组结扎盲肠远端3/4处,并用无菌7号针头在已结扎盲肠远端中央处贯通穿刺,然后把盲肠推回腹腔,关闭腹腔,逐层缝合。Sham组分离盲肠末端后,不进行结扎穿孔,直接关闭腹腔,逐层缝合[3]。所有动物均在术后立即背部皮下注射生理盐水(50 ml/kg),行液体复苏治疗。整个实验过程在室温22~25℃环境进行,术后小鼠自由饮食饮水。
1.3.2 动物模型DIC判断标准
   参照1999年第六届全国血栓与止血会议制定的诊断DIC标准以及Kessler等[5]建立的鼠类DIC模型诊断标准,确立本实验DIC判断标准。即与对照组比较:凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶原时间(APTT)明显延长;纤维蛋白原定量(FIB)、血小板计数(PLT)明显降低;D-二聚体明显升高;并以器官组织切片显示微血管中出现纤维蛋白微血栓作为判断DIC的关键指标。
1.3.3 DIC检测指标
①凝血指标: 全自动凝血分析仪用血凝法检测PT、APTT、FIB。
②纤溶指标:D-二聚体均用ELISA法检测。每孔各加入标准品或待测样品100ul,将反应板充分混匀后置37℃120分钟,用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,每孔中加入第一抗体工作液100ul,将反应板充分混匀后置37℃60分钟。再次洗板,每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。再次洗板,每孔加入底物工作液100ul,置37 ℃暗处反应15分钟。然后每孔加入100ul终止液混匀,30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
③肺、肠系膜组织切片HE染色后在光学显微镜下观察有无微血栓形成。
1.3.4器官损伤指标
①血液:Coulter-JT全自动检测仪检测血小板(PLT);
②肝脏: 全自动生化分析仪化学发光法检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT);
③肾脏: 全自动生化分析仪化学发光法检测血清肌酐(Cr);
④肺、肠系膜组织切片HE染色观察病理损伤改变。小鼠肺、肠系膜组织用10%甲醛固定24 h后,经洗涤、脱水、石蜡包埋、轮转式切片机切成4μm切片,分别进行HE染色。
1.4统计学处理
   采用SPSS18.0统计分析软件对数据进行统计分析。应用生存分析中的Kaplan-Meier法比较各组小鼠存活率的差异;多样本应用方差分析两两比较分析各组小鼠之间的凝血系列和生化的差异。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 生存率分析
术后72h,Sham组小鼠无死亡,存活率均为100%;mCLP组小鼠存活6只,死亡4只,存活率为60%;hCLP组小鼠存活1只,死亡9只,存活率为10%。采用生存分析中的Kaplan-Meier法分析显示,CLP术后,mCLP组小鼠72h生存能力高于hCLP组(P<0.05)。
 
图1 小鼠术后72周存活率
Fig1 survival rate of mice in 72h after CLP

2.2 术后不同时间点小鼠PLT、PT、APTT、FIB和生化值的改变
凝血指标方面,与sham组相比,mCLP和hCLP组小鼠PLT和FIB在CLP术后6小时开始持续下降,24小时后下降趋势减慢,直至72小时最低(P<0.05);hCLP组较mCLP组的PLT和FIB下降更加明显(见图2a,2d)。与sham组相比,mCLP和hCLP组小鼠PT在CLP术后6小时开始明显延长,48h延长出现高峰,随后缓慢回缩(P<0.05)(见图2b); mCLP和hCLP组小鼠APTT在CLP术后6小时开始明显延长,24时延长出现高峰,随后缓慢回缩(P<0.05)(见图2c)。与mCLP组相比,hCLP组的PT+APTT延长更明显(P<0.05)。
肝肾功能指标方面,与sham组相比,mCLP和hCLP组小鼠的ALT在CLP术后6小时开始持续升高,24小时后上升趋势减慢,48h达高峰,随后出现缓慢下降(P<0.05);术后12h开始,hCLP组较mCLP组的ALT上升更加明显(见图2e)。
与sham组相比,mCLP和hCLP组小鼠的Cr在CLP术后12小时开始明显升高,24h达高峰,随后出现缓慢下降(P<0.05);术后12h开始,hCLP组较mCLP组的Cr上升更加明显(见图2e)。

a

b

c

d

e

f

g

图2术后不同时间点小鼠PLT、PT、APTT、FIB和生化值的改变
Fig2 changes of PLT, PT, APTT, FIB, D-dimer, ALT and Cr at different time points after CLP or sham operation.
a PLT; b PT; c APTT; d FIB; e D-二聚体; f ALT; g Cr . * vs sham组, p<0.05.

2.3 肠、肺组织的病理改变
Sham组肠和肺组织则无明显炎症细胞浸润,未见微血栓征象。mCLP和hCLP组小鼠组织切片HE染色发现,CLP术后2小时肠和肺组织开始出现炎症细胞浸润,并逐渐加重,至12~48小时达到高峰,其后逐渐减轻。肺组织严重时可见肺间隔增宽,广泛肺泡壁血管充血,大量炎性细胞浸润。肠系膜结缔组织切片严重时主要表现大量炎症细胞浸润。肠系膜和肺组织CLP术后6h可见微血管微血栓(图3a,b),12~48h数目最多(图3c),hCLP组较mCLP组明显。

B

C

图3 小鼠CLP术后肺与肠系膜组织的病理改变(HE, ×400)。A: CLP术后6h 肺组织混合血栓。B:CLP术后6h肠系膜组织纤维素血栓。C: CLP术后12h肺组织多发血栓。
Fig3. Histological changes in mouse lung and mesentery tissue. Samples were obtained 6 h post-cecal ligation and puncture (CLP) (hematoxylin and eosin; ×400).
A: Mixed thrombus in lung tissue 6 h post-CLP. B: Fibrin thrombus in mesentery tissue 6 h post-CLP. C: Multiple thrombi in lung tissue 12 h post-CLP.

3 讨论
   DIC是一组发生在多种疾病基础上,由致病因素激活凝血系统,导致微血管内广泛微血栓形成,凝血因子被大量消耗及纤溶异常激活,所引起的全身性血栓-出血综合征。DIC的临床诊断可依据血栓与止血国际协会的DIC5步评分法和1999年第六届全国血栓与止血会议制定的诊断DIC标准,但动物模型研究尚缺乏统一标准。据Line等统计结果,至今DIC已有研究应用大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗、猪、羊和灵长类动物等,DIC诱导剂也有脂多糖(LPS)、细菌、高分子右旋糖酐、组织因子、蛇毒、肿瘤、血小板激活因子等数十种 [2]。国内研究应用高分子右旋糖酐和脂多糖比例较高。高分子右旋糖酐诱导DIC模型的原理是引起血管舒缩功能紊乱,血流变慢,为DIC的发生创造条件。脂多糖诱导DIC模型启动机体内源性凝血途径,诱导凝血酶的产生,从而引起广泛的促凝血和促血栓形成作用。脂多糖静脉注射后引起的即刻心血管抑制效应会很大程度上影响模型的存活率[6]。从上述两种模型机理可知,高分子右旋糖酐和脂多糖诱发DIC的病理生理过程与临床尚有很大不同。而据Dempfle等统计,临床脓毒症诱发DIC的发病率高达50%以上[7]。CLP模型目前是用于研究脓毒症最广泛的一种模型,模仿临床上阑尾炎穿孔或憩室炎穿孔导致脓毒症休克的病理生理过程,故尝试应用CLP模型研究DIC 是更符合临床实际的研究手段[8,9]。
   PT和APTT分别反映外源性、内源性凝血功能是否正常,其中PT、APTT时间缩短提示血液处于高凝状态或存在血栓栓塞性疾病,两者时间延长则反映机体有出血倾向。FIB是机体止血生理中重要的凝血因子,FIB增高提示血液处于高凝、高粘状态,易形成血栓,FIB减少时机体可出现出血征象。D-二聚体是纤维蛋白单体经活化因子XIII交联后,再经纤溶酶水解所产生的一种特异性纤溶过程标记物,主要反映纤维蛋白溶解功能。与sham组相比,mCLP和hCLP组小鼠CLP术后6小时PLT、FIB明显下降,APTT+PT延长,D二聚体升高,提示CLP术后小鼠出现FIB过度消耗,纤溶系统功能亢进,出血倾向明显,证实DIC病理生理过程出现。 CLP术后6小时mCLP和hCLP组小鼠出现ALT升高,术后12小时出现Cr升高,提示CLP术后6小时出现多器官功能损害。微血栓是指在小于150μm的微血管中,由血小板、纤维素或/和红细胞组成,HE染色呈粉红色,单纯的红细胞堆积认为是血管中残留的血液,HE染色呈点样深红色。组织病理显示mCLP和hCLP组小鼠CLP术后2小时肠和肺组织开始出现炎症细胞浸润,并逐渐加重,至24~48小时达到高峰,其后逐渐减轻。术后6小时mCLP和hCLP组小鼠肺和肠系膜微血管即开始出现不同程度的微血栓形成,12~48小时更加明显,证实CLP诱发DIC成功。
   CLP模型的预后与动物品系、年龄和性别、盲肠长度和结扎范围、穿刺针尺寸和数目等诸多因素相关。因此,本研究依据2008年Rittirsch等人研究,采用中度与重度CLP模型分组对小鼠的变化进行研究。本研究结果显示,术后72h KM小鼠sham组存活率均为100%,mCLP组存活率为60%,hCLP存活率为10%(P<0.05)。hCLP组较mCLP组PLT、FIB下降幅度更大,APTT+PT延长时间更长,D二聚体升高更为明显,肝肾损害也更加严重,这是选择模型时需要考虑的因素。
   综上所述,CLP小鼠模型能够体现类似临床的DIC的发展过程,重度CLP模型是DIC研究的更好选择。

    2013/3/28 10:51:02     访问数:1921
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