自噬激活对凝血酶所致多泛素化蛋白堆积引起的细胞损伤保护作用的研究

   研究背景:脑出血(ICH)后灶周组织损伤及保护机制的研究是目前ICH领域研究的热点。其中灶周组织自噬的激活是其一个重要机制,而出血诱发释放的过量凝血酶是诱发自噬的重要原因。泛素-蛋白酶体系统(UPS)和自噬同为细胞内蛋白降解的主要途径,在机体中发挥的作用相似而又互补。在病理条件下,UPS损伤后细胞内堆积大量多聚泛素化蛋白,其蛋白清除功能可被自噬作用代偿, p62/SQSTM1正是连接两大蛋白清除途径的重要通路蛋白。而目前仍不清楚ICH是否会对UPS功能产生影响;凝血酶在此过程中扮演什么角色;是否会导致灶周组织中多聚泛素化蛋白质的堆积和p62水平的变化;ICH后灶周组织多聚泛素化蛋白堆积、p62的变化与自噬的激活是否相关;而自噬在ICH后的灶周组织损伤和修复中到底起了保护还是损伤作用。本研究正是基于探索上述问题而进行。
   方法:本研究分为体内和体外实验两部分。体内实验包括:① 实验性脑出血组,实验大鼠基底节注射自体全血100μl;对照组为假手术组。两组大鼠分别于术后1、3、7和14天处死,分别用于蛋白印迹分析、免疫组化染色和EM分析;② 水蛭素治疗组,实验大鼠基底节注射自体全血100μl或全血 + 凝血酶抑制剂水蛭素5U,对照组为假手术组,大鼠在术后7天处死,用于蛋白印迹分析。体外实验:应用原代培养的神经元给予人凝血酶(5U/ml)处理,空白对照组给予等容积的生理盐水,再给予自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)或自噬激动剂雷帕霉素(Rapa)进行干预,24小时后,收集神经细胞分别行蛋白印迹分析、单丹磺酰尸胺(MDC)染色和死亡/存活细胞染色,培养液上清行乳酸脱氢酶(LDH)活性分析。
   结果:① 实验性ICH各个时间点,尤其是3天和7天组,在透射电镜下观察到大量胞浆异常结构和包涵体,与自噬小体并存。② 在实验大鼠ICH后不同时间点,免疫印迹分析结果显示多聚泛素化蛋白水平在从出血第1天开始升高(与β-actin的比值:6.435 ± 0.972),在第3、7天达到高峰(第3天:11.52 ± 0.114;第7天:10.84 ± 0.603),而后逐渐下降(第14天5.595±1.332)。第3天和第7天的多聚泛素化蛋白水平,与第1天和第14天相比,具有显著性差异(P<0.01)。p62的变化趋势与多聚泛素化蛋白相同,蛋白免疫印迹分析和免疫组化结果显示第3天和第7天的p62水平(与β-actin的比值:第3天:1.059 ± 0.268;第7天:0.796 ± 0.077),与第1天和第14天相比具有显著性差异(第1天:0.186 ± 0.052;第14天:0.378 ± 0.093,P<0.01)。③ 实验性ICH水蛭素治疗组7天时灶周组织多聚泛素化蛋白的表达(与β-actin的比值:11.788 ± 0.143)明显少于非治疗组(20.897 ± 1.456),具有显著性差异(p<0.01)。同样地,MC治疗组3天时灶周组织p62蛋白的表达(0.485 ± 0.13)也明显少于ICH非治疗组(1.441 ± 0.228),具有显著性差异(p<0.01)。④ 原代培养的神经细胞在大剂量凝血酶(5U/ml)损伤后,3-MA使多聚泛素化蛋白堆积现象更加严重、p62的上调更加明显;而Rapa则缓解了凝血酶所致的多聚泛素化蛋白堆积和p62上调。⑤ 原代培养神经细胞接受大剂量凝血酶(5U/ml)损伤后,3-MA可明显加重神经细胞的死亡比例,同时致使培养液中的LDH水平升高;反之Rapa可显著降低神经细胞死亡率和LDH水平。
   结论:实验性脑出血导致灶周组织多聚泛素化蛋白堆积及p62水平上调;凝血酶在实验性脑出血后多聚泛素化蛋白的大量堆积和蛋白p62的大幅上调中扮演重要角色;神经细胞经凝血酶损伤后,多聚泛素化蛋白可经自噬途径消化清除,而p62可能是其连接蛋白之一;自噬在凝血酶所致的神经细胞损伤中起到保护作用。

    2013/3/21 10:36:53     访问数:875
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