直接凝血酶抑制剂

作者:许俊堂[1] 
单位:北京大学人民医院[1]
凝血酶的病理生理

凝血酶是一种糖基化的胰蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶,对赖氨酸或精氨酸具有亲和特异性[1]。组织损伤释放组织因子(TF),激活凝血过程形成凝血酶原酶复合物(prothrombinase,因子Ⅹa-Ⅴ-Ca2+),作用于凝血酶原(prothrombin)形成凝血酶(thrombin,Ⅱa)[2]。凝血酶的结构可划分为三个功能区,即催化活性部位、底物识别部位(亦称为anion-binding exosite 1)和纤维蛋白结合部位。催化活性部位是凝血酶活性部位,底物识别部位与特定的阴离子序列有高的亲和性,是与纤维蛋白原,血栓调节蛋白和凝血酶受体等结合的部位[1-3]。
凝血酶的作用可按其作用机制的不同大致分为受体依赖性和非受体依赖性。激活的凝血酶裂解纤维蛋白原(fibrinogen)使其转化为纤维蛋白单体,激活因子ⅩⅢ使纤维蛋白单体转化为不溶的纤维蛋白多聚体,形成稳定的纤维蛋白(fibrin)血栓,激活因子Ⅴ、Ⅷ,对凝血过程起加速和正反馈作用(自放大作用),以上各种作用不依赖于凝血酶受体[2-3]。在血栓形成的同时,凝血酶通过其纤维蛋白结合位点被网罗在纤维蛋白血栓中。体内存在三大天然抗凝系统,激活的凝血酶与内皮细胞表面的血栓调节蛋白(TM)结合,激活蛋白C(PrC),在蛋白S(PrS)的辅助下,灭活因子Ⅴ和Ⅷ;抗凝血酶Ⅲ除直接灭活凝血酶外, 还灭活因子Ⅸa、Ⅹa、Ⅺa、Ⅻa,同时抑制凝血酶的产生,但对和纤维蛋白结合的凝血酶无效;组织因子途径抑制物(TFPI)与激活的因子Ⅹ(Ⅹa)结合形成复合物,灭活因子Ⅲ/Ⅶ复合物,主要抑制外源凝血途径[1]。
现以克隆出二种凝血酶受体[4],主要存在于血小板、内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞、心肌细胞、脑胶质细胞、T淋巴细胞和成纤维细胞等。凝血酶是已知体内最强的血小板聚集剂,使血小板释放5-羟色胺、ADP、血栓素等,进一步激活血小板,对血小板的聚集起放大作用。血小板除参与凝血过程,释放的多种生长因子和血管活性物质参与心血管系统的多种病理生理过程。 凝血酶直接通过其特异受体引起平滑肌细胞分裂、增殖,并可促进血小板源生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、内皮素(ET)和原癌基因c-fos的表达增加,与动脉粥样硬化和在狭窄的发生密切相关;增加内皮细胞通透性,参与细胞趋化和迁移等炎症过程;刺激组织型纤溶酶原激活剂和纤溶酶原激活剂抑制剂的释放,调节内源纤溶过程;参与血管生成和胚胎发育等过程等[5]。另外,在内皮完整的血管,凝血酶引起内皮依赖的血管舒张,而在内皮损伤的部位,凝血酶通过增加内皮素表达和释放引起血管收缩[1]。
凝血酶抑制剂分类
按作用机制,分为直接凝血酶抑制剂和间接凝血酶抑制剂;按作用环节,分为抑制凝血酶产生和抑制凝血酶活性的凝血酶抑制剂;按来源又分为内源性(包括重组制剂)和外源性凝血酶抑制剂(附表),另有凝血酶受体拮抗剂。如肝素是间接凝血酶抑制剂,既抑制凝血酶的产生,也抑制凝血酶的活性[6]。

附表 凝血酶抑制剂的分类
直接凝血酶抑制剂 水蛭素、Hirugen、Hirulog、PPACK、Argatroban、DNA Aptamer
间接凝血酶抑制剂
肝素辅因子Ⅱ依赖性
抗凝血酶Ⅲ依赖性
硫酸肝素
肝素、低分子肝素、肝素样物质
抑制凝血酶产生
因子Ⅹ抑制剂
双香豆素类
因子Ⅶ抑制剂
抗凝血酶Ⅲ依赖性
蛋白C蛋白S系统
可溶性血栓调节蛋白
组织因子途径抑制物
Tick anticoagulant peptide、antistitin、灭活的因子Ⅹ
华法令
因子Ⅶ抗体、因子Ⅶ peptidomimetics
肝素、低分子肝素、肝素样物质
r-PrC

r-TFPI
抑制凝血酶活性
直接凝血酶抑制剂
肝素辅因子Ⅱ依赖性
抗凝血酶Ⅲ依赖性
重组内源性抑制剂
水蛭素、Hirugen、Hirulog、PPACK、Argatroban、DNA Aptamer
硫酸肝素
肝素、低分子肝素、肝素样物质
重组抗凝血酶Ⅲ、重组肝素辅因子Ⅱ
凝血酶受体拮抗剂 Thrombin receptor antagonist peptides

直接凝血酶抑制剂
   直接凝血酶抑制剂对凝血酶的直接抑制和(或)灭活作用不依赖于抗凝血酶Ⅲ、肝素辅因子Ⅱ、蛋白C和组织因子途径抑制物,包括水蛭素(Hirudin),合成的水蛭素片断(hirugen和hirulog),低分子抑制物(D-Phe-Pro-ArgCH2Cl[PPACK]及其衍生物、argatroban)和凝血酶DNA aptamer[1,6]。由于结构的差异,作用机制不同。水蛭素和hirulog同时作用于凝血酶的活性部位和底物识别部位,PPACK和argatroban作用于催化活性部位,而hirugen作用于底物结合部位(附图)。
   与肝素相比较,直接凝血酶抑制剂不被血小板灭活,有抑制凝血酶诱发的血小板聚集的作用[7];对凝血酶的灭活和凝血酶的纤维蛋白结合位点无关,与纤维蛋白结合了的凝血酶仍可被灭活;较少和血浆蛋白结合,抗凝效果与剂量(以aPTT为准)有较好的相关性[1,2,6]。
   水蛭素是含有65个氨基酸的多肽,最初从一种药用蜥蜴(Hirudo medicinalis)的唾液腺中提取出来,现研究与临床应用的制剂是通过基因工程重组得到的,与 天然提取物比较,重组制剂在第63位酪氨酸没有硫酸化,与凝血酶的亲和力大为降低[1,6]。水蛭素分子氨基端的球形头区与凝血酶活性部位相互作用,羧基尾端与结合于底物识别部位,与凝血酶构成能够缓慢解离的紧密的化学计量复合物,抑制凝血酶的活性[8]。水蛭素还可使凝血酶从血小板和其它细胞的特异受体上解离下来。
   Hirugen是合成的水蛭素C端12肽肽段,含有水蛭素的53-64位氨基酸残基,其中63位酪氨酸被硫酸化,与凝血酶的亲和力大为增强,能够阻止凝血酶与纤维蛋白原、血小板上的凝血酶受体等底物结合,但并不影响凝血酶激活因子Ⅴ[9]。在氨基端加上D-Phe-Pro-Arg-Pro-(Gly)4,Hirugen由弱的竞争性抑制剂转变为强的双价凝血酶抑制剂Hirulog。Hirulog是含有20个氨基酸的合成肽,与水蛭素不同的是,Hirulog对凝血酶活性中心的抑制是较短暂的,因为凝血酶能够缓慢裂解氨基端的Arg-Pro键,使Hirulog转变为Hirugen样抑制剂,目前已有对抗裂解的Hirulog衍生物研制成功[9]。
   PPACK使凝血酶活性中心的组氨酸发生乙酰化不可逆灭活,一种PPACK的精氨酸硼衍生物D-Phe-Pro-Arg-borate是更加特异的凝血酶抑制剂,动物实验证明是强力的抗栓剂,并具有较好的口服生物利用度[1,6]。Argatroban是精氨酸的衍生物,是凝血酶的竞争性抑制剂,半衰期仅数分钟[1,6]。虽然Argatroban在体外具有强的抗凝血酶特性,但动物和人体实验效果不肯定。DNA aptamer是含有15个核苷酸的单链DNA aptamer,高亲和作用于凝血酶的anion-binding exosite 1,与Hirugen一样,只抑制凝血酶与底物的结合,对凝血酶的活性无直接作用。动物模型有较好的抗拴效果,半衰期仅几分钟[1,6]。
临床药理和1期临床研究显示,重组水蛭素口服难以吸收,其静脉和肌肉注射的半衰期分别为40分钟和2小时,分布容积8.9-17.2L,肝代谢极少,95%经肾排出[1]。静脉Hirulog的半衰期只有15-20分钟,总体清除速率明显快于水蛭素,经蛋白分解、肝代谢和肾排出清除[1]。在健康志愿者,水蛭素、Hirulog和Argatroban具有良好的剂量耐受性,无明显副作用;有较好的量效关系,不引起出血时间延长。
直接凝血酶抑制剂的动物实验研究
在绝大多数动脉血栓动物模型,水蛭素、Hirulog和PPACK,与肝素等抗凝剂比较,可明显加速 t-PA引起的血管再通,减少残留血栓,减少再闭塞的发生;减少深动脉损伤后的血小板沉积和血栓形成;明显降低猪动脉拉伤或兔动脉粥样硬化球囊扩张模型4周后的动脉局部狭窄程度[10-12]。
直接凝血酶抑制剂在临床的应用
血栓形成是组织损伤、血小板聚集和凝血酶形成共同作用的结果,血栓形成不但与冠状动脉的急性事件(急性心肌梗塞、不稳定心绞痛、血管重建术后急性血管血栓闭塞)有关,还参与动脉粥样硬化和再狭窄的发生发展,有效的抗凝措施应充分抑制动脉局部富血小板血栓的形成[1-3]。目前,肝素和(或)阿司匹林仍是抗凝的主力军,但对血栓形成的抑制作用远未理想,新型抗血小板和抗凝制剂应运而生,其中研究最热门的是直接凝血酶抑制剂和血小板Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂,其中以直接凝血酶抑制剂争论最多。
1 急性心肌梗塞溶栓疗法
   溶栓疗法暴露局部损伤创面和大量血栓结合的凝血酶,纤溶激活凝血酶的形成,有效的抗凝措施才能保持血管的持续通畅,减少或避免再梗塞的发生[13]。Hirulog的应用可明显增加链激酶和阿司匹林溶栓的冠脉再通比率,并减少溶栓后心脏事件的发生,和肝素比较至少不增加出血事件的发生[14]。水蛭素作为t-PA或链激酶溶栓辅助措施,TIMI-5、TIMI-6和HIT实验的结果令人振奋[1,6],与肝素比较,水蛭素不但增加冠脉再通比率,而且可减少心梗后死亡和冠脉再闭的发生,至少不增加出血副作用,这就导致了3期临床试验HIT-Ⅲ、GUSTO-Ⅱa、和TIMI-9A的进行,结果却有些出乎意料[15-16]。
   HIT-Ⅲ试验因水蛭素致颅内出血增加,在收入302例病人后被提前终止。GUSTO-Ⅱa[15]比较水蛭素和肝素在一组急性冠脉综合征(不稳定心绞痛和急性心肌梗塞)病人对复合终点(死亡和再梗塞)的影响,方案为水蛭素0.6mg/kg静注,续0.2mg/kg/h,和肝素5 000IU静注,续1 000IU/kg(体重>80kg为1 300IU/kg)。结果肝素和水蛭素组皆引起出血性脑卒中的增加(分别为1.3%和0.7%,而GUSTO-Ⅰ为0.5%-0.7%),亚组分析也发现,只在接受溶栓治疗的病人颅内出血明显增加(分别为1.8%和0.3%)。TIMI 9A[16]使用同样抗凝方案,同样出现颅内出血增加倾向(肝素和水蛭素组分别为1.7%和1.9%),年龄大于75岁和aPTT升高预示着风险的增加。两试验在同时降低水蛭素和肝素剂量后重新开始,水蛭素0.1mg/kg静注,续0.1mg/kg/h;肝素5 000IU静注,续1 000IU/h,维持aPTT于55-85s,分别称为GUSTO-Ⅱb和TIMI 9B[17-18]。
   GUSTO-Ⅱb[17]是13个国家的373家医院参加的大规模多中心随机双盲试验,共计入选12 142例病人。入选病人胸痛在12小时以内,短暂或持续ST段抬高或降低大于0.5mv,或持续T波倒置大于1.0mv。结果,用药24小时水蛭素组死亡或心肌梗塞的发生明显下降(分别1.3%和2.1%,P<0.001),48-72小时与肝素组比较仍存在显著差异,以后随时间这种差异消失。观察30日,主要复合终点事件(死亡、非致命性心梗和再梗塞)在两组无显著性差异。本研究水蛭素的效果主要体现在降低整体病人急性心肌梗塞和再梗的发生,与ST段是否抬高无关。水蛭素组出血事件不增加,两组无显著差异。TIMI 9B[18]有150个国家参加,入选3 002例病人,随机分入水蛭素组和肝素组,观察30日,两组在抗凝治疗效果、主要终点事件和出血合并症方面并无显著差别。
   HERO试验证明Hirulog可明显提高90-120分钟冠造冠脉开通率。发病12小时以内的急性心肌梗塞患者412例,给予链激酶溶栓的同时,随机分为三组,肝素组5000U静注,续1000-1200U/h,60小时;低剂量Hirulog组,0.125mg/kg静注,续0.25mg/kg/h 12小时,然后0.125mg/kg/h;高剂量Hirulog组,0.25mg/kg静注,续0.5mg/kg/h 12小时,然后0.25mg/kg/h。结果90-120分钟冠造达到TIMI Ⅲ级的比率在三组分别为35%、46%和48%,48小时冠脉再闭分别为7%、5%和1%,随访35日复合终点事件分别为25%、19%和17%,大出血在三组分别为28%、14%和19%(White HD, Aylward PE, Frey MJ, et al. Randomized, double-blind comparison of hirulog versus heparin in patients receiving streptokinase and aspirin for acute myocardial infarction(HERO). Circulation, 1997, 96: 2155-2161.)。
   近来,Theroux等人公布了Argatroban用于心肌梗塞的试验(Argatroban in myocardial infarction, AMI)的初步结果。AMI是二期随机双盲安慰剂对照实验,将链激酶溶栓病人随机分为低、中两个剂量Argatroban组和安慰剂组。随访30日复合终点事件3组无差别,但胸痛3小时内溶栓亚组病人,较高剂量Argatroban组有显著的危险性降低。Argatroban的安全谱较好,在链激酶溶栓基础上用Argatroban不增加出血[19]。
2 经皮冠状动脉成形术(PTCA)
   球囊扩张使动脉粥样硬化斑块破裂,组织因子释放,激活凝血系统,激活血小板引起局部血小板聚集。有实验研究表明,动脉拉伤局部凝血酶产生在5h达高峰,持续至少10日[3]。在组织损伤的同时,也破坏了血栓调节蛋白介导的蛋白C抗凝系统和t-PA介导的纤溶系统。尽管阿司匹林和肝素在PTCA术中常规应用,急性(24小时内)血管血栓闭塞发生率仍达4%-6%,尤其在高危病人(不稳定心绞痛、急性心肌梗塞),而且早期血栓形成对后期再狭窄的发生有密切关系[3]。
   Topol等[1,6]于1993年报告在291例PTCA病人以Hirulog替代肝素的剂量递增试验,两高剂量组急性血管闭塞的发生率明显低于两低剂量组,随剂量增加未见副作用增加。Bittl等[20]报告了在北美和欧洲121个临床医疗中心进行的大规模随机对照试验,共入选不稳定心绞痛或梗塞后心绞痛行PTCA术病人4098例,随机分入组(Hirulog 1.0mg/kg静注,续2.5mg/kg/h 4h,然后0.2/kg/h 14-20h)和高剂量肝素组(175IU/kg静注,续15IU/kg/h 18-24h)。结果,与肝素比较,Hirulog整体上不降低主要终点事件的发生(住院期间死亡、急性冠脉闭塞和心源性病情急剧恶化),但明确减低出血合并症的发生(分别为3.8%和9.8%)。亚组分析见704例梗后心绞痛病人,Hirulog明显减少主要终点事件和出血合并症的发生。
   Van den Bos等人[1,6]在113例稳定心绞痛行PTCA手术病人,2:1分入水蛭素组和肝素组,静注24h,以aPTT调节用药剂量。水蛭素组病人围手术期心脏事件明显减少,Holter监测缺血事件明显下降,这就促使进一步3期临床试验的实施。
   HELVETICA[21]是一大规模多中心随机双盲试验,1141例不稳定心绞痛病人分入以下三组,肝素1 000IU静注,续15IU/kg/h 24h, 然后安慰剂每日2次皮下注射3日;水蛭素40mg静注,续0.2mg/kg/h 24h,然后安慰剂每日2次皮下注射3日;水蛭素40mg静注,续0.2mg/kg/h 24h,然后40mg每日2次皮下注射3日。结果,虽然两水蛭素组早期(96h)心脏事件较肝素组明显减少,但随访7周这种获益已不复存在,6周冠状动脉造影结果在3组也未显示差别,出血事件在3组相同。
3 不稳定性心绞痛
   不稳定心绞痛伴随斑快溃疡或破裂,富血小板血栓形成,肝素对和纤维蛋白和创面基质结合的凝血酶无效,易为血小板第4因子破坏,失去活性;阿司匹林对血栓素以外的血小板聚集剂无效,尤其在高凝血酶的环境中[6]。尽管使用阿司匹林和肝素治疗,5-10%的不稳定性心绞痛病人在住院期间仍然要发生急性心肌梗死或者顽固心绞痛。
   早期的小规模试验证实了直接凝血酶抑制剂的疗效和安全性[22]。Topol和同事[23]将163例不稳定心绞痛病人给予四个剂量水蛭素或高、低两个剂量的肝素治疗,造影随访显示水蛭素组病人罪犯血管定量冠脉造影结果明显好于肝素组,而且,急性心肌梗塞的发生明显下降。TIMI-7[24]将410例病人分入4个不同的Hirulog剂量组,观察72小时剂量组间心脏事件的发生无显著差异,但出院时死亡和非致命心梗的发生率在3个高剂量组明显低于低剂量组,6周后仍维持,出血事件0.5%,本研究的缺点是缺乏肝素对照。
   OASIS-1试验入选909例无ST段抬高的心肌缺血病人,随机分为肝素组、低剂量水蛭素和高剂量(0.4mg/kg静注,续0.15mg/kg/h 72小时)水蛭素组。结果,7日主要终点事件在三组分别为6.5%、4.4%和3.0%,用水蛭素病人更少搭桥手术,停药后两水蛭素组病人有一过性心脏事件增加。随访180天,水蛭素仍明显好于肝素。
   由于OASIS-1良好的结果,OASIS-2试验入选了10 141例无ST段抬高的急性冠脉综合征病人,随机双盲分为肝素组(5000U静脉注射,然后15U/kg/h)和水蛭素组(0.4mg/kg静注,续0.15mg/kg/h)共 72小时。结果7日心血管死亡或新的心肌梗死两组分别为4.2%和3.6%(相对危险0.84,P=0.077),心血管死亡、新的心肌梗死或顽固心绞痛分别为6.7%和5.6%(相对危险0.82,P=0.0125),这种差别在72小时内尤为明显。需要介入干预的病人在水蛭素组明显少于肝素组。虽然水蛭素组需要输血的大出血有所增加(1.2%比0.7%,P=0.01),但危及生命的出血和脑卒中两组无明显差别。随访35日,死亡或心肌梗死两组分别为7.7%和6.8%,P=0.06。将OASIS-1和OASIS-2合并分析,7日和35日水蛭素组死亡或心肌梗死下降分别为19%(P=0.039)和14%(P=0.04)。 综合分析OASIS-1、OASIS-2、TIMI-9B和GUSTO-IIb的结果,72小时死亡或心肌梗死下降22%(P=0.0004),7日(P=0.002)和35日(P=0.016)效果稍有下降,但仍维持显著性水平。(Effects of recombinant hirudin(lepirudin) compared with heparin on death, myocardial infarction, refractory angina, and revascularization procedure in patients with acute myocardial ischemia without ST elevation: a randomized trial. Organization to assess strategies for ischemic syndromes(OASIS-2) investigators.
思考与展望
   无数研究证实了凝血酶在急性冠脉综合征发生、发展中的关键作用,不但参与凝血过程,还通过其特异受体引起血小板聚集、刺激平滑肌细胞和内皮细胞增生、诱发粘附分子表达引起白细胞趋化等广泛的生物活性[5]。但有关直接凝血酶抑制剂的3期临床试验并未象基础实验和早期临床实验一样的令人振奋,尤其在远期作用方面未显示出优点。
   众所周知,肝素-抗凝血酶Ⅲ复合物既作用于凝血酶,也灭活因子Ⅸa、Ⅹa、Ⅺa、Ⅻa,抑制凝血酶的活性同时还减少凝血酶的产生,而水蛭素只对激活的凝血酶起灭活作用[13,25]。溶栓剂在溶解血栓的同时,既有血栓结合的凝血酶的暴露和释放入血,也有液相凝血酶的激活、产生增加。水蛭素并不阻止凝血酶的产生,少量未能灭活的酶由于凝血酶和血小板激活的自身放大作用,进一步诱使凝血酶大量产生,一旦克服水蛭素的作用,就会激活血小板,引起血栓形成[13]。另外,常规剂量的水蛭素对凝血酶诱发血小板聚集的抑制作用远不如对抑制血栓形成的作用为强[3]。动物试验水蛭素剂量(1.0-2.0mg/kg,续0.5-2.0mg/kg/h)明显高于人体试验,这可能是体外、动物实验与人体实验结果出现明显差别的主要原因[10-12]。
我们也注意到,从GUSTO-Ⅱa、TIMI-9A到GUSTO-Ⅱb、TIMI 9B,首剂水蛭素剂量从0.6mg/kg大幅度减至0.1mg/kg,不知能否对试验结果产生大的影响,并由此得出不同结论[15-18]。GUSTO-Ⅱa 发现[15],颅内出血只在同时应用溶栓剂和水蛭素的亚组病人增高,因此,在其它病人组水蛭素的剂量应高于或与GUSTO-Ⅱa 相同才能得出正确结论。近来研究证明,血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体抗体c7E3不但降低PTCA术急性并发症,还减少再狭窄的发生,由此说明血小板在急性冠脉综合征的发生和发展中的作用[26];也有研究显示,小剂量直接凝血酶抑制剂和血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂合用较两者之一更能增加实验血栓溶栓的血管开通时间,减少再闭塞的发生[27],因此未来的抗凝方案应着重抑制凝血酶产生、凝血酶活性和血小板功能三个方面。
    2013/2/26 17:40:55     访问数:5057
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