花生四烯酸代谢组学在动脉粥样硬化发生机制研究中的应用

作者:朱毅[1] 
单位:北京市北大医学部[1]
  代谢是生命活动中所有(生物)化学变化的总称,代谢活动是生命活动的本质特征和物质基础。因此,对代谢物的分析向来就是研究生命活动分子基础的一个重要突破口。代谢组学是通过检测、量化和编录代谢组及其变化规律,研究生物过程分子基础和机制的科学。它以组群指标分析为起点,以高通量检测和多元统计数据挖掘为手段,通过生物体内所有代谢物进行定量分析确定代谢物与生理病理变化的关系。正因如此且作为系统生物的一个重要组成部分,代谢组学在其诞生的近10年里已在功能基因组学、药物毒理学、病理生理学和环境科学等学科领域的研究中得到了广泛应用并取得了突出成绩,目前已经发展出了包括液相色谱串联质谱法(LC-MS-MS)技术与磁共振波谱(NMR)技术在内的多种代谢组检测分析方法。
  动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是严重危害人类健康的常见病与多发病,欧美国家疾病致死原因的50%以上与动脉粥样硬化密切相关,我国近年来,动脉粥样硬化的发病率也呈现逐年上升和年轻化的趋势。动脉粥样硬化斑块的形成过程主要包括低密度脂蛋白及其代谢产物在内皮下空间的积累,巨噬细胞的浸润和血管平滑肌细胞的迁移与增殖[1]。继而导致血管内膜增厚、斑块形成、血管重塑和冠状动脉堵塞,造成急性心肌梗死。脂质代谢紊乱和炎性反应在动脉粥样硬化的病理过程中起到很重要的作用。动脉粥样硬化是与遗传和环境包括饮食和习惯相关的复杂的多因素的疾病。
  花生四烯酸(arachidonic acid)是5,8,11,14-二十碳四烯酸的简称,属于n-6系列的人体必需多不饱和脂肪酸,简记为20∶4(n-6)。它是生物体内分布最广泛而且具有重要生物功能的一种多不饱和脂肪酸,是很多生物活性物质合成的前体。在细胞内,花生四烯酸主要以磷脂化形式存在于细胞膜内表面。当细胞受到某种刺激时,在磷脂酶A2(PLA2)的作用下被分解成游离形式释放到细胞液中,进而在一系列代谢酶的作用下形成大量的具有较强生物活性的代谢物。目前知道至少有三类酶包括环氧化酶(cyclooxygenases,COXs)、脂氧酶(lipoxygenases,LOXs)和细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)参与了花生四烯酸的代谢,形成近百种具有不同生物活性的二十碳衍生物(eicosanoids)。COX和LOX是分别形成包括前列腺素(如前列环素和血栓素A2),羟基二十碳四烯酸(HETEs),白三烯(LTs)和 脂氧素等的双氧化酶。CYP酶是单氧化酶,包括表氧化酶和ω-羟化酶,表氧化酶分解花生四烯酸生成多种表氧-二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoicacids,EETs),而ω-羟化酶则将花生四烯酸代谢产生19-HETEs、20-HETEs等小分子活性物质[2]。
  
1 花生四烯酸代谢产物在动脉粥样硬化发生机制中的作用
  花生四烯酸及其代谢产物在人体的生理稳态以及许多重大疾病的病理生理过程中有非常重要的调节作用。已有研究证实,其多个代谢产物与动脉粥样硬化的发生密切相关。
1.1 前列腺素与动脉粥样硬化
  COX是花生四烯酸合成前列腺素(PGs)过程中的重要限速酶,该酶有2种亚型,即COX-1和COX-2。COX-1是一种持续表达的结构型酶,在人体的血小板、内皮细胞、肾脏等几乎所有器官、组织、细胞中都能检测到,参与胃肠细胞、血小板聚集及肾脏血流的生理性调节;COX-2属于诱导型酶,在生理状态下一般不表达,只有当细胞受到刺激因素如生长因子、细胞因子(白细胞介素1、肿瘤坏死因子、转化生长因子、血小板衍生生长因子、血小板活化因子)、脂多糖、肿瘤诱导剂(如佛波酯等)等后才被诱导表达。
  在COX作用下,花生四烯酸代谢生成前列腺素G2(prostaglandin G2,PGG2),再生成前列腺素H2(prostaglandinH2,PGH2),这些产物再转化为其他类型的PGs产物,具体生成哪类PGs与细胞种类和状态有关。在血管壁中主要依赖COX-2的催化作用产生前列环素(prostaglandin I2,PGI2),在血小板中主要依赖COX-1和血栓素A2合成酶催化生成血栓素A2(TXA2)。二者生物活性作用相反,TXA2有强烈的血小板聚集、血管收缩和促使平滑肌细胞的迁移的作用,而PGI2则有很强的抑制血小板聚集和明显松弛动脉的作用。在正常的生理状态下,循环血中TXA2和PGI2的水平处于相对平衡状态,这是维持血液循环畅通的重要因素之一。TXA2/PGI2失衡可导致血栓形成和组织缺血的一系列生理机能的改变,一旦某些原因使TXA2/PGI2比值升高,就会诱发血小板聚集,释放5-羟色胺、血小板通透因子、平滑肌细胞因子等活性物质,损伤血管壁,成为动脉粥样硬化发生的原因[3]。
1.2 白三烯与动脉粥样硬化
  白三烯(LTs)是花生四烯酸的重要代谢产物。炎性细胞在刺激因素作用下被激活,细胞膜磷脂被裂解为花生四烯酸,先结合到5-脂氧酶激活蛋白,再递呈到核膜上的5-脂氧化酶(5-lipoxygenase,5-LOX),催化花生四烯酸形成5-羟过氧化二十碳四烯酸(5-HPETE),随即转化为不稳定的中间产物白三烯A4(LTA4)。LTA4一方面通过白三烯C4合成酶等生成白三烯C4(LTC4)、LTD4和LTE4;另一方面在水解酶作用下水解生成LTB4。
  LTs在动脉粥样斑块组织尤其是复杂的晚期斑块和软斑块处表达异常丰富[4]。LTs通过促进单核细胞向内皮细胞黏附和迁移、并向巨噬细胞与泡沫细胞转化、促进血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖、激活淋巴细胞以及刺激冠状动脉的收缩等多种途径,参与AS的发生与发展。
  研究表明, LT B 4 能显著增强I C A M - l 和VCAM-1与单核/巨噬细胞膜表面配体β1和β2整合素的亲和力,促使单核细胞发生黏附和贴壁,启动内皮炎性反应。LTB4还可上调单核/巨噬细胞膜表面ox-LDL受体(CD36)的表达,从而促使巨噬细胞吞噬胆固醇脂质并向泡沫细胞转化,使斑块内脂质堆积,张力增加,导致不稳定斑块形成和进展[5]。病理组织分析发现LTC4主要集中分布在VSMC聚集、内膜增厚以及粥样斑块形成的部位。此外,LTC4和LTD4可显著加强冠状动脉对刺激的收缩反应。
1.3 EETs与动脉粥样硬化
  花生四烯酸经CYP450表氧化酶作用生成EETs,EETs通过开放血管平滑肌细胞膜上的Ca2+活化的K+通道(BKCa),使平滑肌细胞膜因K+外流出现超极化而导致血管舒张,被认为是一种内皮衍生性超极化因子(EDHF)。EETs有4种结构异构体,即5,6-EETs、8,9- EETs、10,11-EETs和14,15-EETs,其中11,12-EETs和14,15-EETs为主要代谢产物。11,12-EETs和14,15-EETs可以适度的抑制血小板源性生长因子(PDGF)引起的大鼠主动脉平滑肌细胞迁移。11,12-EETs被证明可通过激活cAMP依赖的PKA途径来抑制平滑肌细胞的迁移。血小板的超极化与抑制内皮细胞黏附密切相关,EETs通过激活BKCa通道使血小板超极化,其中11,12-EETs最为有效[6]。此外,11,12-EETs还可以减弱TNF-α诱导的细胞黏附分子和内皮细胞选择素(E-selectin)的表达[7]。
  E E Ts 在机体中主要经可溶性表氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase,sEH)的作用而被快速代谢转变成相应的二氢二十碳三烯酸(DHETs),使EETs丧失其生物活性。编码sEH的基因是Ephx2,在社区动脉粥样硬化相关研究中发现Ephx2的遗传变异,尤其是K55R多种不同等位基因的出现,可能是白种人先天性心脏病临床事件发生的重要危险因素[8]。在自发性高血压大鼠、AngⅡ型高血压大鼠模型中应用sEH抑制剂,均可降低大鼠的血压。已有研究证实,AngⅡ通过激活内皮细胞上的AP-1从而上调sEH转录可能是促成AngⅡ诱导高血压形成的原因[9]。
  
2 基于液相色谱串联质谱法(LC-MS-MS)方法的花生四烯酸代谢组学在研究动脉粥样硬化发生机制中的应用
2.1 LC-MS-MS原理与优势

  液相色谱串联质谱法也称为“液质联用”方法,该方法以液相色谱作为分离系统,以质谱仪作为检测系统,它将液相色谱优秀的分离能力和质谱的高灵敏度、高特异性等优点结合起来,成为一种分析有机分子的强大方法。针对于花生四烯酸代谢组学研究,LCMS-MS系统主要被用来靶向性地监测花生四烯酸各代谢产物的含量。
  L C - M S - M S 方法所用的液相色谱系统多为高压液相系统(H P L C)或超高压液相系统(UPLC),相比于普通的液相系统具有更好的分离能力,这对于复杂体系的分析至关重要,许多花生四烯酸代谢产物结构相似甚至互为同分异构体,如果不能得到良好的分离将无法准确地检测到各代谢产物的含量。分离花生四烯酸代谢产物所用的色谱柱多为反相柱,各产物由于其极性的不同而被分离。
  在花生四烯酸代谢组学研究中,LC-MS-MS方法中的质谱主要起靶向性定量的作用,因此,与液相色谱偶联的质谱仪多为电喷雾-三重四极杆类的质谱(triple quadrupole,QqQ),相比于其他类型的质谱仪器,该类质谱具有更强的定量能力。三重四极杆类质谱的检测器由三个串联的四极杆元件组成(分别称为Q1,q2和Q3),每个四极杆元件具有多种扫描方式,三重四极杆类质谱可通过对三个四极杆元件的扫描方式的组合,实现功能更为强大的扫描模式。其中,在靶向性花生四烯酸代谢组学中应用最多的三重四极杆扫描模式为“多反应检测(MRM)”,在这种扫描模式中,Q1选择性地使某个质量电荷比(m/z)的离子通过(母离子),在q2中,这个离子经惰性气体碰撞而解离,产生碎片离子,Q3则选择性地使某个碎片离子(子离子)通过。这个过程中的母离子与子离子共称为MRM离子对,通过MRM离子对检测花生四烯酸的各代谢产物具有较好的特异性。
2.2 目前可用LC-MS-MS检测的花生四烯酸代谢产物
  早在1995年,人们就利用LC-MS分析了p450通路的花生四烯酸代谢产物,但由于所使用的质谱仪器不是串联质谱,该方法必须要求良好的液相分离效果。之后,LC-MS-MS被应用到花生四烯酸代谢产物的研究中,Wheelan等在人的嗜中性粒细胞中检测了5-LOX通路的代谢产物[10]。随着技术的发展,可被LC-MS-MS方法检测的花生四烯酸代谢产物的种类越来越多,已报道可被该方法检测的代谢产物已有八十余种[11];检测限可达0.1~1.0pg[11,12]。
2.3 LC-MS-MS检测在动脉粥样硬化发生机制中潜在的应用
  Mallat等利用LC-MS-MS技术研究了颈动脉粥样硬化患者斑块中HETEs,EETs和oxo-ETEs的含量,发现发病人群动脉粥样硬化斑块中的HETEs含量显著高于未发病人群,其中由非酶促反应生成的花生四烯酸代谢产物9-HETE的含量最高,且变化最显著,提示非酶促的脂质过氧化可能与斑块的不稳定性有关[13];Willey等研究了从动脉粥样硬化患者外周血液中分离出的单核细胞中5-HETE和LTB4在钙激动剂A23187刺激前后的改变情况[14];一些工作以HETEs或8-iso-PGF2a作为氧化应激的指标,研究了动脉粥样硬化相关模型中的氧化还原状态[15,16]。尽管尚未在动脉粥样硬化发生机制的研究中得到广泛的应用,人们已经意识到花生四烯酸代谢组学在该领域中的应用潜力,针对于血浆、组织液、尿液、细胞、组织等不同生物样品的脂质提取方法均已被开发。基于LC-MS-MS的花生四烯酸代谢组学方法将越来越多地应用于与动脉粥样硬化相关的各种模型中,对阐述花生四烯酸代谢产物与动脉粥样硬化发病机制的关系起重要作用。
  
3 NMR方法在研究动脉粥样硬化发生机制中的应用
3.1 NMR方法的优势
  NMR的优点包括:样品前处理相对简单;客观性和重现性好;样本用量小;检测速度快;无创性,便于活体原位检测,不破坏代谢物的结构,因此可重复操作。但是检测的灵敏度相对较低,仪器购置和维护相对费用较大。采集的相关样品要保证时间及空间的一致性,减低除给予的特定刺激之外的刺激因素的影响,以保证相关的尿液、血液、组织、细胞、培养液和植物提取液能够有效反映相关信息。代谢组学的研究已经应用于基础生命科学、药物研发、病理生理、营养与植物药学和环境科学等方面。在病理状态下,生理状态的平衡就会被打破,生物体发生代谢紊乱,尿液和血液等体液就会反映出相关的变化,从而动态地监测疾病的发生和发展,进一步认识其发病机制,为预防、诊断和治疗提供便利。
3.2 NMR方法在动脉粥样硬化发生机制中的应用
  Brindle等发现血浆中的VLDL,LDL,HDL和胆碱是区分动脉硬化导致冠心病患者与正常人的重要因素[17]。同时也能对其严重程度进行有效区分。这种血浆NMR的诊断方法有望成为临床检测动脉粥样硬化的有效有段。Martin等给仓鼠高脂饮食诱导动脉硬化,用NMR检测血浆中的物质变化,发现VLDL、N-乙酰糖蛋白与疾病状态呈正相关[18]。这些物质能够预测89%的动脉粥样硬化的易感性,而血浆中的总胆固醇仅能预测60%。这说明血浆中的代谢产物能够通过检测血浆中的潜在的标志物,有效诊断饮食诱导的动脉粥样硬化。NMR不仅能够检测在循环体液中代谢产物的变化,在组织样本的提取物中亦然。Mayr等用NMR检测出动脉粥样硬化模型的10周龄ApoE基因敲除小鼠丙氨酸与鸟苷酸的大量减少,并通过联用蛋白质组学与代谢组学,在整体蛋白水平以及代谢产物的水平上为阐明动脉硬化的免疫应答反应、氧化应激和能量代谢的相互作用提供了依据[19]。动脉粥样硬化是一个慢性炎症的疾病过程,人们也将研究的兴趣放在炎性反应的分子机制在动脉硬化的发生发展中的作用。Chen等发现动脉粥样硬化发展过程中棕榈酸、硬脂酸等脂肪酸代谢发生紊乱,其中棕榈酸能够通过凋亡和炎症途径明显地加重动脉粥样硬化[20]。
  
4 总结
  生物体的存在既受遗传调控,又受环境的影响,因此基因组学、转录组学和蛋白质组学检测出的变化在外因的作用下有可能不会发生。代谢组学是生物物质变化的最终环节,最有可能完成达到动态的整体的对生物体的全面认识,建立生命活动的关联性。代谢组学不是传统意义上的少数几个代谢物的发生某种变化,而是整体动态的代谢产物的变化,向上推出所受影响的相关环节,与蛋白质组学测定的相关变化蛋白找到对应关系,并进一步推向相互联系的转录组和基因组的变化,进而推出从基因到转录到蛋白质再到代谢的网络调控机制。相信随着代谢组学应用的广度和深度的不断增加,我们将会更充分认识到其优越性,这也将为人类更深入地认识动脉粥样硬化的发生过程,揭示其发病机制提供一种强有力的手段。

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2013/2/1 19:23:22
张永华:很好,学习了。
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