瑞舒伐他汀对同型半胱氨酸诱导的大鼠血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶-2表达和细胞迁移的影响

关键词  同型半胱氨酸 瑞舒伐他汀 基质金属蛋白酶-2 细胞迁移
   [摘要] 目的 观察瑞舒伐他汀对同型半胱氨酸(Hcy)诱导大鼠血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达以及对血管平滑肌迁移的影响,探讨Hcy致动脉粥样硬化以及他汀药物逆转的可能机制。 方法 体外培养大鼠主动脉平滑肌细胞,加入不同浓度的Hcy分别作用 24、48和72h;在1000μmol/L Hcy浓度下分别加入不同浓度的瑞舒伐他汀干预,采用免疫印迹法和明胶酶谱法检测细胞培养上清液中MMP-2的表达及酶的活性。在Transwell小室外室中加入1000μmol/L浓度的Hcy,内室加入定量的大鼠平滑肌细胞悬液,分别培养24、48和72h,观察Hcy对平滑肌细胞迁移侵袭力的影响;同时加入不同浓度瑞舒伐他汀溶液,分别培养24、48和72h,观察瑞舒伐他汀对Hcy诱导平滑肌细胞迁移侵袭力的影响。 结果 Hcy浓度在50-5000μmol/L时促进血管平滑肌细胞MMP-2蛋白的表达;Hcy浓度在50~1000μmol/L时增强血管平滑肌细胞MMP-2的酶活性,浓度在5000μmol/L时抑制血管平滑肌细胞MMP-2的活性。瑞舒伐他汀浓度在10-9~10-5mol/L时,能抑制Hcy对血管平滑肌MMP-2表达和酶活性的增强作用。Hcy在1000μmol/L浓度下能刺激血管平滑肌细胞迁移,72h刺激作用强于48和24h;瑞舒伐他汀可以抑制Hcy对血管平滑肌细胞迁移的刺激作用,72h抑制作用强于48和24h。 结论 Hcy能影响血管平滑肌细胞MMP-2蛋白的表达,瑞舒伐他汀能抑制Hcy对血管平滑肌细胞MMP-2的表达和酶的活性增强作用,并能抑制Hcy对血管平滑肌细胞迁移的刺激作用,这可能是瑞舒伐他汀抗动脉粥样硬化的作用之一。 
   瑞舒伐他汀是一种新型降脂药,它具有降脂、抗炎等一系列作用[1],同型半胱氨酸(Hcy)是动脉粥样硬化发生的一个独立危险因子,已有研究表明Hcy与动脉粥样斑块中胶原代谢关系密切,能促进胶原的合成,血管平滑肌细胞(VSMC)的迁移和增殖促进动脉粥样硬化斑块的形成,与基质金属蛋白酶-2(MMP-2)所致的细胞外基质重构有关[2]。本研究观察瑞舒伐他汀对Hcy诱导大鼠VSMC MMP-2 表达以及对VSMC迁移的影响,探讨瑞舒伐他汀抗动脉粥样硬化的可能机制。
1材料和方法
1.1实验动物和试剂 雄性Wistar大鼠(体重150g)由浙江大学医学院动物室提供。DMEM培养基和胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司;瑞舒伐他汀由英国阿斯利康公司提供;兔抗MMP-2抗体购自Lab Vision公司;辣根过氧化物酶标记的鼠兔通用型二抗购自Dako公司;D-L-同型半胱氨酸购自美国Sigma-Aldrich 公司;Transwell购自美国Corning公司;其他试剂均为进口或国产分析纯。
1.2方法
1.2.1 VSMC的培养 胸主动脉平滑肌细胞原代培养参考文献[2]。采用免疫组织化学鉴定VSMC。取第4~7 代细胞接种于30ml培养瓶中,加含10%胎牛血清的DMEM低糖培养液培养48h,待瓶内细胞长满80%左右,换无胎牛血清的DMEM低糖培养液继续培养24h,使细胞同步增长后再消化接种于含10%胎牛血清6孔细胞培养板中,每孔细胞终浓度为2×105个/ml。然后加入不同浓度的Hcy,使其终浓度分别为 0、50、100、500、1000、5000μmol/L [3];瑞舒伐他汀终浓度分别为10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、0mmol/L(Hcy终浓度为1000μmol/L) [2];分别培养24、48及72h,4℃ 12000转/min离心收集各细胞培养上清液,-70℃保存备用。
1.2.2明胶酶谱分析法 细胞培养上清液以Bradford法进行蛋白定量后,每泳道取20μg蛋白上样于含0.1%明胶的聚丙烯酰胺凝胶上恒压电泳(浓缩胶60V,分离胶100V),待溴酚蓝到达凝胶底部,切下聚丙烯酰胺凝胶,去离子水洗涤2次,然后在室温下用洗涤缓冲液(2.5% Triton X-100)55RPM平摇漂洗30min×2次,然后用孵育缓冲液(0.05M Tris-HCl pH 8.8 ,5mM CaCl2,0.02%NaN3) 在37℃ 条件下55RPM平摇孵育过夜。用含0.1%考马斯亮蓝R-250(W/V)的脱色液(甲醇:冰醋酸:水=4.5:1:4.5)对凝胶进行避光染色1h,然后以脱色液脱色2h,去离子水清洗胶块终止脱色。相对于蓝色背景下白色条带的出现表明白明胶酶的存在。应用凝胶成像系统拍照,Quantity One 4.6对电泳条带进行定量分析,每个试验重复3次。
1.2.3免疫印迹法检测 细胞培养上清液以Bradford法进行蛋白定量后,分别取20μg蛋白与5×上样缓冲液混合后沸水浴3min,4℃12000转/min离心5min,取上清上样于聚丙烯酰胺凝胶上恒压电泳(浓缩胶60V,分离胶100V),待溴酚蓝到达凝胶底部,切下聚丙烯酰胺凝胶,以湿转法(电压100V)转移到聚二乙烯二氟化物膜(PVDF膜)上。此膜在4℃下用含有5%脱脂奶粉的TBST液封过夜,然后用抗MMP-2单克隆抗体温育过夜。用TBST洗两次,TBS洗一次后,55RPM平摇,10min/次,再用辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2h,再分别经TBST(二次)及TBS(一次)洗涤后,Beyo-ECL Plus化学发光,暗室柯达X-OMAT BT胶片曝光,显影定影后扫描成像,Quantity One4.4软件定量分析,每个试验重复3次。
1.2.4细胞迁移试验 取4~7代VSMC,血清饥饿使细胞生长同步化后,进行细胞迁移试验。Transwell板(Corning,0.8μm),内室加入200μLVSMC悬液(2×105个/ml),外室中加入1ml Hcy(5000、1000、500、100、50、0μmol/L),各自培养48h。Transwell板(Corning,0.8μm),内室加入200μl VSMC悬液(2×105个/ml),外室中加入1ml瑞舒伐他汀溶液(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、0mol/L,Hcy终浓度为1000μmol/L);各自培养48h。干预结束以棉签轻轻擦去上层未穿透膜的VSMC,取下Transwell的半透膜,PBS洗涤3次,3.7%多聚甲醛室温固定5min,再以PBS洗涤3次,苏木素染色5min,流水冲洗后,半透膜用中性树胶封片,显微镜下随机取5个视野计数穿透膜的细胞数并计算均数。
1.3统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件,计量资料以X±s表示,比较采用t检验。
2结 果
2.1 MMP-2酶解活性 Zymography分析发现,蓝色背景上的白色透明条带分子量为72kD,即为MMP-2所在的条带。用酶解明胶量表示MMP-2活性,Hcy在50~1000μmol/L时增强MMP-2的酶解活性(P<0.05);而Hcy在5000μmol/L时抑制MMP-2的活性(P<0.05);相同浓度Hcy干预条件下,72h的作用明显强于48h和24h(P<0.05)(图1)。
   瑞舒伐他汀在10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L浓度条件下均能抑制1000μmol/L的Hcy对MMP-2酶解活性的增强作用(P<0.05);瑞舒伐他汀浓度越高,抑制作用越明显;相同浓度Hcy干预条件下,72h的抑制作用明显强于48h和24h(P<0.05)(图2)。
2.2 MMP-2蛋白的表达 Hcy在50~5000μmol/L时能增强VSMCMMP-2蛋白的表达(P<0.05);相同浓度Hcy干预条件下,72h的作用明显强于48h和24h(P<0.05)(图3)。
   瑞舒伐他汀在10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L浓度条件下均能抑制1000μmol/L的Hcy对VSMCMMP-2蛋白表达的增强作用(P<0.05);瑞舒伐他汀浓度越高,抑制作用越明显;相同浓度瑞舒伐他汀干预条件下,72h的抑制作用明显强于48h和24h(P<0.05)(图4)。
2.3细胞迁移试验 Hcy在50~5000μmol/L时能促进VSMC迁移;Hcy浓度越高促进作用越强(P<0.05)(图5)。
   瑞舒伐他汀在10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L浓度条件下均能抑制1000μmol/L的Hcy对VSMC迁移的促进作用;瑞舒伐他汀浓度越高,抑制作用越明显 (P<0.05)(图6)。
3讨 论
   高同型半胱氨酸血症已被确立为动脉粥样硬化的独立危险因子,但其致动脉粥样硬化的机制以及如何使用药物逆转高同型半胱氨酸血症所致的动脉粥样硬化尚不完全清楚。动脉粥样硬化斑块的进展表现为伴随细胞和脂质聚集到病变动脉内膜下的过度血管重建[4]。Zempo等报道VSMC的迁移与增殖而致动脉粥样斑块的形成需 MMP-2所介导的细胞外基质的重构[5]。MMP-2能刺激VSMC迁移和巨噬细胞聚集到血管内膜下,在血管壁,MMP-2主要由VSMC、内皮细胞和巨噬细胞分泌,它们持续的表达和释放大量的酶原形式的Pro-MMP-2到细胞外间隙[6]。本实验通过明胶酶谱法及免疫印迹法,以不同浓度Hcy作用于体外培养的VSMC,发现Hcy在50~1000μmol/L时促进MMP-2的表达,72 h作用最明显,表明Hcy可促进VSMCMMP-2的表达,从而有效降解基底膜,为平滑肌细胞迁移至血管内皮下扫清道路,促使动脉粥样斑块的形成,这可能是Hcy致动脉粥样硬化的机制之一。本实验还发现Hcy在5000μmol/L时抑制平滑肌细胞MMP-2的酶解活性,机制可能是高浓度Hcy改变了MMP-2的分子结构,从而使MMP-2活性降低。
   他汀类药物被广泛用于治疗导致动脉粥样硬化的血脂紊乱。瑞舒伐他汀是一种较新的降脂药物,有许多独特的优点,如低亲油性、高肝选择性、极低的代谢率及与细胞色素P450之间相互作用较低[7]。瑞舒伐他汀在强大的降脂作用之外,它还有许多独立于降脂作用之外的有益于心血管系统的作用-即它的“多效性”作用。Guo H等在LDLR基因缺如的小鼠动脉粥样硬化模型中发现瑞舒伐他汀可抑制粥样斑块中MMP-2的表达[1]。Preusch MR等研究发现在球囊扩张损伤颈动脉大鼠模型中血浆中MMP-9水平明显升高,但予口服瑞舒伐他汀后血浆MMP-9水平明显下降。可能的机制是瑞舒伐他汀通过调节NO等炎症因子、细胞因子的释放改善了血管内皮功能,并通过抑制HMG-CoA还原酶而影响一系列细胞代谢,从而影响MMP-9的表达[8]。Weinberg EO等研究发现未完全堵塞冠状动脉的大鼠模型中,口服瑞舒伐他汀组通过影响细胞因子及炎症因子的释放能显著减少心肌梗塞的面积[9]。本试验观察到瑞舒伐他汀能抑制Hcy对VSMC分泌MMP-2的刺激作用,瑞舒伐他汀作为HMG-CoA还原酶抑制剂,它能抑制甲羟戊酸的生成。甲羟戊酸代谢产生鲨烯,后者是胆固醇和GGPP的前体,在蛋白的烯化中起重要作用。瑞舒伐他汀干预后可以引起VSMC和泡沫细胞内甲羟戊酸匮乏。GGPP或甲羟戊酸能补救被洛伐他汀抑制的兔VSMC和泡沫细胞分泌MMPs暗示抑制蛋白烯化可能是他汀对MMPs分泌抑制效果产生的一个机制[10]。瑞舒伐他汀也可能通过相同的机制抑制MMP-2的表达。瑞舒伐他汀抑制Hcy诱导的细胞迁移可能与抑制MMP-2的表达有关;有研究表明PI3K/Akt信号传导通路在调节VSMC增殖和迁移过程中起重要作用[11],但本试验中这种抑制作用是否和PI3K/Akt信号通路有关尚需要进一步研究。
4参考文献
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    2012/1/19 12:05:58     访问数:1800
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2012/1/20 21:19:19
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