巴曲酶对下肢深静脉血栓患者内皮祖细胞的影响

【关键词】:巴曲酶;内皮祖细胞;深静脉血栓

【摘要】 目的 探讨巴曲酶(DF-521)对下肢深静脉血栓(LEDVT)患者外周血内皮祖细胞(EPCs)数量的影响,以及DF-521在体外对EPCs功能的影响。 方法 36位DVT患者被随机分为DF-521治疗组和对照组。在DF-521治疗前后,测定患者外周血中EPCs的比例。另外,在体外培养的条件下,检测EPCs在不同浓度DF-521的影响下的增殖、分泌一氧化氮、新生血管、以及分化情况。结果 DF-521治疗组中DVT患者外周血EPCs的比例高于对照组(P<0.05)。在体外培养条件下,DF-521显示出对EPCs增殖、分泌一氧化氮以及新生血管功能的增强作用(P<0.05)。EPCs在DF-521的诱导下向内皮细胞分化。 结论 DF-521可以增加LEDVT患者外周血EPCs的数量,在体外环境下改善EPCs的功能活性,而且内皮型一氧化氮合酶可能在其中起重要的作用。

静脉血栓综合征包括深静脉血栓(DVT)以及肺栓塞,它是非常常见的血管疾病,仅次于心脑血管疾病,具有很高的发病率以及死亡率[1]。深静脉血栓中最常见的是下肢深静脉血栓形成(lower extremity deep venous thrombosis,LEDVT),LEDVT的治疗一般是抗凝和溶栓。然而,目前还没有一项既有效又安全的治疗。大约10%的LEDVT患者在治疗过程中发生了肺栓塞[2]。除此之外,抗凝溶栓治疗还有很多并发症,最常见的就是出血。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是内皮细胞(endothelial cells,ECs)的前体细胞,存在于骨髓和外周血中,参与出生后的受损血管内皮的修复和血管重建[3]。巴曲酶(batroxobin, DF-521)是一种从巴西具窍腹蛇蛇毒中提取出的丝氨酸蛋白酶,具有改善纤溶、抑制血小板聚集、扩血管以及改善微循环的作用。它已经被广泛的应用于治疗心脑血管疾病以及外周血管疾病。本次研究旨在观察巴曲酶对LEDVT患者外周血EPCs数量的影响,体外条件下DF-521对EPCs功能的影响,并探讨其作用机制。

1  资料与方法

1.1  病例

LEDVT的诊断主要依靠彩超以及临床表现。本次研究病例选取的要求:患者既往未发现慢性疾病及先天性疾病,如糖尿病、高血压、贫血、HIV等;年龄在20岁-40岁;发病时间不超过7d。26位患者以1:1的比例被随机的分为DF-521治疗组和对照组。治疗组的治疗方案为:DF-521+抗凝和溶栓;对照组的治疗方案为:相同剂量的抗凝和溶栓。治疗时间为7d。

1.2  荧光激活细胞分选

在治疗前后取患者空腹外周血50μl,肝素抗凝,并用PBS将血液稀释到1.5ml。用PE- VEGFR2(50μg)和FITC-CD34(50μg)进行双染色,37°C避光孵育30min。用流式细胞仪进行荧光激活细胞分选。每次分选至少涉及1×106个单个核细胞。

1.3  EPCs的分离、培养和鉴定

应用密度梯度离心法从健康人外周血中分离出外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)。用条件培养液M199(含20%胎牛血清和20ng/ml血管内皮生长因子)将PBMCs放入附有人纤维连接蛋白的12孔培养板中进行诱导培养。每孔PBMCs的接种密度为(1–3)×106/ml。3d后换液,弃非贴壁细胞。培养至第7d进行EPCs的鉴定。Dil-acLDL(2.4μg/ml)和FITC-UEA-1(10 μg/ml)对贴壁细胞进行避光下的双染色,用激光共聚焦显微镜观察染色情况,双染色阳性细胞为EPCs。EPCs鉴定完后,收集EPCs,用M199重悬,分组:实验组(4组,DF-521的浓度分别为:1×10-2 U/ml, 2×10-2 U/ml, 4×10-2 U/ml, 8×10-2 U/ml)和对照组(M199)。

1.4  EPCs增殖能力的检测

用MTT分析来判断EPCs的增殖能力。EPCs在96孔板内分组培养24h后,将加入MTT(5g/L)加入各孔后孵育6h。弃上清液,与DMSO再孵育10min。用分光光度器测定每孔标本的吸光度(波长为490nm)。

1.5  EPCs分泌NO能力的检测

通过检测各组培养液中NO的浓度来判断EPCs分泌NO的能力。吸取分组培养24h后的每孔上清液各100μl,按照NO试剂盒介绍的方法,用分光光度器对上清液进行测定(波长为490nm),根据测出的吸光度值再计算出NO的浓度值。

1.6  EPCs血管形成能力的检测

以EPCs在基质胶上形成管腔结构情况来判断EPCs的血管形成能力。将等量基质胶(10mg/ml)在冰浴条件下覆盖于24孔培养板内,常温下待基质胶凝固后,将各组EPCs以每孔5×104的密度接种于基质胶上,37°C孵育24h。倒置显微镜下观察各组EPCs形成管腔结构的情况,并对管腔数量计数。用DiI-acLDL和FITC-UEA-1对各组管腔结构进行双染色,激光共聚焦显微镜下再次观察。

1.7  EPCs分化情况的检测

向各组中加入FBS,并使其浓度达到20%,继续培养,每3天换液一次,直至第20d。收集各组贴壁细胞。一部分细胞被用于流式细胞仪检测CD31和vWF的表达,,另一部分细胞被电子透射显微镜用于观察细胞的超微结构。

1.8  统计分析

采用SPSS10.0统计软件,单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

结果

2.1  DVT患者EPCs的数量

治疗前对患者外周血CD34+KDR+细胞的检测结果显示两组无显著差异。在分组治疗7d后,再次检测患者外周血CD34+KDR+细胞时显示,DF-521治疗组患者外周血CD34+KDR+细胞的含量显著增加(从治疗前的0.41%±0.14%到治疗后的0.67%±0.19%, P<0.05,表1)。

2.2  EPCs的鉴定

PBMCs在培养至第4d时形成细胞集落(图1,A),培养至第7d时细胞呈现梭形(图1,B)或圆形。在激光共聚焦显微镜下DiL-acLDL和FITC-UEA-1双染色阳性呈现为黄色的细胞为EPCs(图1,C,D,E)。

2.3  DF-521对EPCs增殖能力的影响

比较各组吸光度值检测结果(表1),各实验组的吸光度值均高于对照组,最高值位于8×10-2U/ml DF-521治疗组,而且这个效应呈现剂量依赖性(P<0.05)。

2.4  DF-521对EPCs分泌NO能力的影响

通过比较各组的NO浓度发现实验组中NO浓度均高于对照组(表1),最高浓度为:41.6μmol/L,位于8×10-2U/ml DF-521治疗组,这个效应同样具有剂量依赖性(P<0.05)。

2.5  DF-521对EPCs血管形成能力的影响

结果显示各实验组的管腔数都比对照组的多(表1,P<0.05)。尤其在4×10-2U/ml DF-521治疗组,这组中的管腔数量最多,而且其结构也比其他组别更加复杂(图1:F,G,H,I)。

2.6  DF-521对EPCs分化能力的影响

经过20d的培养,流式细胞仪的检测结果显示实验组贴壁细胞CD31和vWF的表达比例均大于对照组(表2 ,P>0.05),但在各治疗组之间,贴壁细胞CD31和vWF的表达比例没有明显差异。用电子透射显微镜观察细胞的超微结构,不仅观察到丰富的线粒体和溶膜酶等细胞器,而且发现内皮细胞的特有结构:帕怀特小体(图1:J)。它的长度一般为1.3 μm,直径一般为0.1 μm。

讨论

Asahara在1997[4]年首次报道了从PBMCs中分离出EPCs,而且EPCs参与血管形成。随后的研究显示EPCs表达CD34、 KDR 和 CD133,可以摄取AC-LDL,结合UEA-1[5]。EPCs具有多向分化潜能,除了向ECs分化,有报道显示EPCs还可以分化为平滑肌细胞[6]和心肌细胞[7]。内皮的损伤和修复之间的动态平衡是维持血管内皮正常功能的关键,而EPCs是参与修复的一个重要因素[8]。EPCs的数量和活性可以被很多外界因素干扰,如糖尿病、高血压、血液系统疾病等[9]。在心脑血管以及外周血管疾病中,血栓形成扮演着重要角色。血栓的形成和再通涉及很多方面,如细胞因子、成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞以及粒细胞等[10]。有研究对血栓成分的分析,结果显示血栓内的内皮细胞不仅来自血管壁还有一部分来自循环中的血液[11]。近期有报道显示:增加外周血中EPCs可以帮助血栓的再通[12]。这表明EPCs可能在这方面也发挥着重要重要。

研究显示DF-521可以改善冠状血管和外周血管的缺血情况,抑制血管内膜增生[13]。近期国内的学者报道DF-521可促进CD34细胞参与的脑缺血后局部血管新生[14]。鉴于EPCs可以表达CD34,我们推测DF-521可能是通过EPCs发挥这些积极的作用。因为EPCs可以同时表达CD34和VEGFR,我们认为通过DF-521的治疗,增加了LEDVT患者外周血中EPCs的数量。在体外培养的条件下DF-521可以改善EPCs的增殖功能,而且这个体外效应呈现剂量依赖性。我们推测DF-521对EPCs增殖能力的改善可能是增加患者外周血EPCs数量的原因之一。当然也可能是通过对骨髓EPCs的动员而增加了外周EPCs的数量,这是我们下一步研究的方向。血管新生能力是EPCs的一个最重要功能,它直接反映了EPCs对损伤血管的修复和重建作用。本次实验显示DF-521能够增强EPCs的新生血管能力,但是这个效应并不像影响增殖能力一样呈现一个梯度增长模式。我们考虑这可能与DF-521对纤维蛋白原的降解从而减弱了细胞间连接有关[15,16],但是这需要进一步的研究以证实。在EPCs分化为ECs的过程中,细胞表型CD34和CD133的表达逐渐减弱,伴随着的是ECs表型表达的增强,如CD31和vWF。帕怀特小体由单层膜包绕一些高电子密度的棒状小体构成,这些棒状小体大多是由微丝组成。帕怀特小体是合成和储存Ⅷ因子相关抗原的结构, 它被认为是鉴定成熟ECs的金标准。通过电子透射显微镜对细胞超微结构的观察以及流式细胞仪对细胞表型的分析,可以看出DF-521可以将EPCs诱导分化为ECs,而不是向其他细胞系的横向分化。

NO是一种重要的扩血管因子,它对维持心血管系统起着重要作用。在EPCs和ECs中,NO 的产生主要依赖于内皮型一氧化氮合酶。有研究显示增强内皮型一氧化氮合酶活性可以改善EPCs的增殖和分化能力[17,18]。本次研究显示出DF-521对EPCs分泌NO的能力有促进作用,并且这个作用也具有剂量依赖性。我们由此推断DF-521对EPCs增殖和分化的影响可能是通过改善内皮型一氧化氮合酶的活性发挥的。

综上所述,DF-521可以增加LEDVT患者外周血EPCs的数量,而且在体外培养条件下DF-521能够促进EPCs的活性以及诱导其向ECs的分化,而且内皮型一氧化氮合酶可能在其中发挥着重要的作用。

参考文献

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10.   Furie B, Furie BC. Thrombus formation in vivo. J Clin Invest 2005; 115:3355-3362.

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14.   蔡振利,周东,徐树军. 大鼠局灶脑缺血/再灌注模型CD34表达及巴曲酶对其表达的影响. 中风与神经疾病杂志,2006,1:97-99.

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图1  体外培养下EPCs的生长。 EPCs集落, 第4d(A,×200)。 EPCs 形态, 第7d(B,×200)。 激光共聚焦显微镜观察经荧光染色的细胞(×400), 结合FITC-Lectin-UEA-1的EPCs(C), 摄取DIL-AC-LDL的EPCs(D), 双染色阳性EPCs(E)。 管腔形成(×400), 1×10-2U/ml DF-521(F), 2×10-2U/ml DF-521(G), 4×10-2U/ml DF-521(H), 8×10-2U/ml DF-521(I)。 电子透射显微镜下的超微,帕怀特小体(j,箭头所示,×20000)。

文本框: ○B

表2  DF-521对EPCs活性的影响

组  别

增殖能力

NO浓度

(μmol/L)

管腔形成数量

(/ HP)

对照组

0.42±0.04

15.4±0.5

1.3±0.2

1×10-2U/ml

0.49±0.03a

20.5±0.6a

2.0±0.4a

2×10-2U/ml

0.61±0.05b

26.1±0.5b

3.1±0.5b

4×10-2U/ml

0.71±0.03c

34.4±0.8c

3.9±0.4a,e

8×10-2U/ml

0.82±0.04d

40.6±0.7d

3.3±0.3b

注:与对照组比较, a P<0.05; 与1×10-2U/mlDF-521比较, b P<0.05; 与2×10-2U/mlDF-521比较, c P<0.05; 与4×10-2U/mlDF-521比较, d P<0.05; 与8×10-2U/mlDF-521比较, e P<0.05。

表3 第20d贴壁细胞CD31和vWF的表达情况(

±s,%)

组别

CD31

vWF

对照组

40.2±0.2

34.1±0.3

1×10-2U/ml

67.2±0.3 ×

60.8±0.1 ×

2×10-2U/ml

66.8±0.1×

61.2±0.2 ×

4×10-2U/ml

66.6±0.7 ×

60.3±0.5 ×

8×10-2U/ml

67.1±0.3 ×

60.6±0.4 ×

注:与对照组比较, × P<0.05。

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    2011/5/13 14:05:53     访问数:1828
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