气血理论与心肌能量代谢

  几个月来,新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)疫情在全球肆虐。除了典型的呼吸系统表现,也有一定比例的COVID-19患者出现了心脏受累的临床表现。根据国家卫生健康委员会COVID-19诊疗方案的指导原则,国家老年医学中心/国家老年疾病临床医学研究中心、中国老年医学学会心血管病分会专家组结合收治危重型COVID-19患者的临床救治经验,针对COVID-19相关心肌损伤提出《新型冠状病毒肺炎相关心肌损害的临床管理专家建议》。建议认为, COVID-19引起心肌损害的机制包括:氧供 - 需失衡相关的损伤、病毒感染可能导致心肌直接损伤、心脏原因、全身性疾病等,并针对不同类型的患者给出了治疗建议。其中,心肌能量代谢障碍是主要的心肌损害机制之一,改善心肌能量代谢的药物在专家建议中得到推荐。


  正常的心脏功能需要与之精确匹配的心脏能量代谢。心脏能量及功能的变化伴随着从心肌缺血之初到最终心力衰竭的始终,可见于所有心肌损害相关的疾病。随着人们对心血管疾病研究的深入,心肌能量代谢的调节可能成为心肌损害至心力衰竭治疗的有效策略。优化心肌能量代谢可能显著改善由于心肌缺血造成的其他不良反应。心气虚与心肌能量代谢有着密切的关系。研究发现益气中药可以改善心脏功能同时优化心肌能量代谢代谢。中医气血理论强调气对血的统帅作用中药益气法治疗CHF的理念与改善衰竭心脏能量代谢有共通之处,近年来进行了很多有关的临床和实验研究,取得了较肯定的疗效。


  中医研究发现心气虚证在心衰之前就已经存在,并贯穿于心肌肥厚和心衰始终,心气虚证进一步加重可以导致阳虚、血瘀、水停等其他证候而引起心衰的发生发展和恶化,这与能量代谢障碍贯穿于心肌肥厚和心衰的始终并促进其发生发展具有相似之处。既往研究表明心气虚证与心功能的减低密切相关,补气药黄芪、党参等是治疗心衰的有效药物,黄芪对心衰、缺血缺氧、再灌注损伤和病毒损伤的心肌,具有保护心肌线粒体结构、提高生物氧化相关的多种酶的活性、减少乳酸脱氢酶外漏等作用,从而改善心肌能量代谢。现将本团队关于益气药物在能量代谢方面的研究介绍如下:


1. 黄芪注射液对肥大心肌细胞的能量代谢影响的研究

  1.1 黄芪能抑制肥大心肌细胞增殖期的SDH活性的代偿性升高 

心脏是高度依赖ATP的器官。线粒体位于心肌细胞胞浆,大约构成了心肌细胞总胞浆的1/3,是产生ATP的主要场所。线粒体的结构有内膜、外膜、基质和膜间隙。线粒体的呼吸链由五个酶组成,这些酶共同完成氧化磷酸化作用,产生细胞内不同代谢过程所需的ATP。在生理状态下,线粒体可以严格调控氧化磷酸化的能力。SDH被认为是线粒体标志酶,在线粒体内三羧酸循环中共发生4次脱氢反应,SDH催化第3次脱氢反应,该酶活性降低时,除直接影响琥珀酸脱氢反应外,尚能阻断相继发生的第4次脱氢反应,从而减少了ATP的产生。


  稳定代偿期(时点24h)的肥大心肌细胞的β-MHC增生明显。虽然β-MHC节省能量,但是收缩能力差,必将导致更多β-MHC增生,收缩单位的增多大大增加了能量消耗。心肌细胞产能也将代偿性增加(线粒体的标志酶SDH活性将增强),产能增强的同时伴随着线粒体的损伤,脂肪代谢的抑制。产能的增强是为了满足肥大心肌细胞不断增长的能量需求,但却以损伤产能结构为代价,如线粒体DNA的缺失、线粒体超微结构受损、腺苷转移酶发生同功型转换,长期下去可出现心肌细胞肌原纤维溶解,肌浆网畸变,溶酶体增加,线粒体结构受损等,肥大心肌细胞进入失代偿期。肥大心肌细胞在负荷下表现出节能趋势,即β-MHC增加,这样,虽然收缩单位的能量利用率提高,但收缩单位的增多大大增加了能量消耗。这为肥大心肌细胞的“能量饥饿”埋下伏笔,这就不难理解肥大心肌细胞后期会进入衰竭期、心肌肥厚会转向心力衰竭。 


  本实验研究结果发现细胞内SDH活性AngⅡ组高于空白并有非常显著的统计学差异(P<0.01),说明AngⅡ致肥大的心肌细胞产能代谢增强,产生ATP的能力增强。这种变是为了适应肥大心肌细胞能量需求。 

黄芪、Lorsartan、Lorsartan+黄芪均能对抗AngⅡ导致的心肌细胞内SDH活性的上升。由于Lorsartan是AngⅡ受体AT1的阻断剂,所以能够阻断AngⅡ诱导心肌细胞肥大的作用,心肌细胞蛋白增生减少,没有超出正常的能量需求,所以SDH活性比AngⅡ组降低。目前没有资料证实黄芪具有阻断AngⅡ受体AT1的作用,那么黄芪注射液可能改善了肥大心肌细胞能量“能量不足” 、“能量饥饿”的状态,减小了肥大心肌细胞能量需求矛盾,使代偿性升高的SDH活性降低。其具体机制有待进一步研究。


  1.2 黄芪能抑制肥大心肌细胞增殖期的LDH活性的升高 

  在正常情况下,细胞LDH存在于细胞内,当心肌细胞受到损伤时,单位膜结构发生变化使细胞释放较多的LDH,使培养液中LDH活性增强, LDH的含量可以反映心肌细胞损伤程度。本实验结果显示,AngⅡ致肥大的心肌细胞24小时各组之间的培养液中漏出的LDH活性没有无统计学差异(P>0.05),说明此时细胞没有明显损伤。 

LDH是心肌细胞质的标志酶,一般认为定位于细胞质的肌浆网上,作用是氧化乳酸变成丙酮酸,从而使其进入柠檬酸循环,为机体供能,LDH可以代表糖代谢中无氧酵解的活性。在心肌肥大的发生和进程中,心肌细胞的产能结构也出现明显的适应性改变,即胚胎型的肌酸激酶同功酶(BB+MB)和乳酸脱氢酶同功酶(M-LDH)的含量及活性均有明显提高,肥厚心肌细胞能量代谢途径从有氧氧化向无氧酵解转化,这一现象一方面提示压力负荷性心肌肥厚能量需求增加,另一方面也提示可能存在的能量缺乏状态。


  本文观察结果显示细胞内LDH活性AngⅡ组高于空白并有非常显著的统计学意义(P<0.01),说明AngⅡ致肥大的心肌细胞糖酵解增强。肥大心肌细胞对底物的利用发生了变化,对糖的利用率增加,糖酵解作用增强,说明细胞处于“能量饥饿”状态。提高葡萄糖利用率降低脂肪利用率是一种防御性措施,但是长期的脂肪酸、三酰甘油的积聚可能使脂肪酸酰化损耗ATP、长链脂肪酸抑制腺苷酸转移酶活性、从而导致线粒体产生的ATP和线粒体外的ADP交换速率下降,进一步影响能量代谢。 


  黄芪、Lorsrtan、Lorsartan加黄芪均能显著降低AngⅡ导致的心肌细胞内LDH活性的上升(P<0.01)。lorsartan能阻断AngⅡ的作用,使心肌细胞能量需求趋于正常,所以LDH活性降低。黄芪可能通过改善心肌细胞“能量饥饿”的状态,缓解心肌细胞的能量代谢矛盾,或者改善心肌细胞对底物(糖和脂肪酸)的利用状况,减少了糖的利用率,从而降低了细胞内LDH的活性。


  1.3 黄芪抑制肥大心肌细胞的线粒体膜电位的升高 

  线粒体由内外两层彼此平行和高度特化的单位膜包围而成,外膜通透性高,好似一个网状体,分子量小于10000道尔顿的分子均可通过。内膜对多数物质的通透性很低,组成也比外膜复杂得多,其中含有呼吸链酶组。内外膜之间为外室。内膜包围的间隔为内室,其中充满凝胶状基质,故又称基质室。与三羧酸循环、脂肪酸和丙酮酸氧化等有关的酶系均存在于基质中。线粒体内膜上的呼吸链酶组分参与氧化磷酸化过程。三羧酸循环的主要终产物为CO2、NADH+和FADH2。后两者的电子进入内膜呼吸链并沿呼吸链酶组分传递,其间释放的能量用于将基质中的H+定向转运至内膜外,从而形成跨线粒体内膜两侧的H+梯度和电位梯度,这样就形成了线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)。 


  H+借助线粒体膜电位从内膜外进入基质的过程中释放能量,在呼吸链的终端将O2还原成H2O,在内膜的ATP合成酶作用下促使ADP和Pi结合生成ATP。 除产生ATP外,线粒体膜电位还执行另一个重要的功能,即摄取Ca2+以维持胞浆中游离Ca2+的低浓度(<10-7mol)。Ca2+不仅和心肌细胞的收缩偶联密切相关,而且Ca2+是心肌细胞的第二信使。Ca2+对于保持细胞内环境的稳定性有重要意义,Ca2+在诱导细胞凋亡中的重要作用也已得到大量实验证实。所以线粒体的细胞呼吸、氧的代谢、酶活性、能量供应的功能、内环境的稳定都与线粒体膜的通透性即跨膜电位差密切相关。肥大心肌细胞蛋白增生,能量需求增加,产能代谢增强,ATP合成速率加快,造成线粒体内膜两侧H+浓度差增大,故引起线粒体膜电位增高。 


  本实验采用先进的激光扫描共聚焦显微镜的方法来观察细胞线粒体膜电位。激光扫描共聚焦显微镜(laser confocal scanning microscopy,LCSM)作为一种集激光、显微镜和计算机于一体的新型、高精度显微镜,是近十几年来发展起来的大型生物学分析仪器。借助荧光标记方法,结合激光扫描、光学显微镜、计算机技术可对所观察细胞内荧光标记的物质进行定量、定性、定位的监测。LCSM在光敏剂亚细胞定位研究中的应用有着其他仪器所不可比拟的优越性。LCSNM的最大优点在于采用点光源、照明针孔与检测孔共轭成像,激光束能产生高准直性光线以高分辨率聚焦于直径小于0.5μm的一点或标本的一个平面以形成标本的共聚焦光学层面,在焦平面上下的光线被排除在最后成像之外,而主要从标本的一个层面发射出的荧光被收集后成像,这样就有效避免了焦外模糊成像,避免了传统光学显微镜由于光散射造成的图像信噪比降低、图像清晰度和分辨率不高的缺点,从而在很大程度上提高了分辨率和灵敏度,使细胞的形态及结构的分析更精确。

 

  本实验结果显示AngⅡ作用24h后心肌细胞的线粒体膜电位显著升高,AngⅡ组与Control组有非常显著的差异(P<0.01)。这可能与心肌细胞蛋白增生,所需能量增加,线粒体代偿性产生ATP增加有关。线粒体氧化呼吸作用增强,增加了ATP的产生,线粒体内膜两侧H+浓度差增大而导致线粒体膜电位增高。

 

  黄芪可显著抑制AngⅡ对体外培养心肌细胞的线粒体膜电位的增强作用(P<0.01)。提示黄芪可以抑制线粒体膜电位的病理性增高,减轻心肌细胞产能的代偿,从而改善心肌细胞的能量代谢。


2. 黄芪组分对肥厚心肌能量代谢的干预作用和机制研究

  本研究显示AngⅡ作用于体外培养的乳鼠心肌细胞24h后,即引起心肌细胞的总CK活性下降,至48h下降更明显,其分子机制在于AngⅡ作用于体外培养的乳鼠心肌细胞24h后出现CK-B亚基的表达增加而CK-M亚基的表达减少,mi-CK表达无明显变化,其直接结果使CK同功酶中,CK-BB比例增加,CK-MB无明显变化,CK-MM比例减少,最终导致总CK活性下降。本研究证实AngⅡ可干预乳鼠能量代谢相关酶的mRNA表达,从而影响酶的活性及相关能量代谢化学反应的进行。黄芪皂苷、黄芪多糖或黄芪皂苷加多糖与AngⅡ共同作用于体外培养的乳鼠心肌细胞48h可抑制AngⅡ引起的CK-B亚基表达增加而CK-M亚基表达减少和CK-BB比例增加CK-MM比例减少以及总CK活性的下降。本实验证实黄芪组分可在分子水平上抑制AngⅡ对体外培养乳鼠心肌细胞能量利用方面相关酶的影响。 其次,本研究发现AngⅡ作用于体外培养的乳鼠心肌细胞24h后,即引起ATP合成酶F1亚基β肽的表达增加,至48h后表达减少,而在此过程中未观察到ATP合成酶活性的改变。ATP含量在24h亦未见显著改变,48h可见含量显著增加。黄芪皂苷或黄芪多糖或黄芪皂苷加多糖与AngⅡ共同作用于体外培养的乳鼠心肌细胞在48h可完全抑制AngⅡ引起的F1-ATPaseβ表达减少,并部分抑制AngⅡ引起的ATP含量的显著增加,黄芪多糖的抑制作用更显著。本实验证实黄芪组分可在分子水平上抑制AngⅡ对体外培养乳鼠心肌细胞ATP合成过程中相关酶的表达及ATP含量的影响。


  2.1 本研究是国内外首次进行的体外培养乳鼠心肌细胞CK的mRNA表达研究及CK同功酶组成研究。本实验采用REP法检测CK同功酶组成,发现乳鼠心肌细胞中,CK同功酶以CK-BB所占比例最大,其次为CK-MM,CK-MB最少,且未见sarcomeric mito-CK条带。本实验在预实验阶段曾做乳鼠心肌组织CK同功酶组成电泳分离,发现其组成是:CK-MM>CK-MB>CK-BB>mito-CK。这与以往研究成年鼠心肌组织和人类心肌组织的结果不同,他们的研究结果是:在成年鼠及人类心肌组织中CK-MM最多,其次为mito-CK,再次为CK-MB,CK-BB比例最少。以往研究在发生心力衰竭的成年鼠心肌组织或人类心肌组织中以CK-MB增加为主,而本研究体外培养的乳鼠肥大心肌细胞模型中以CK-BB增加为主。二者的差别主要体现在CK-BB和mito-CK上,分析其差别的来源可能在于选择实验动物的年龄不同,以往实验选择的是成年鼠或成年人的心肌组织,而本试验选择乳鼠的心肌细胞。文献报道CK-BB主要存在于动物脑组织中,它同时也是人胚胎中CK的主要存在形式。那么可以推测它可能也是胎鼠或乳鼠中CK的主要存在形式,因此可以解释我们在体外培养的乳鼠心肌细胞中CK同功酶以CK-BB所占比例最大以及发生心力衰竭时以CK-BB增加为主的现象。sarcomeric mito-CK主要存在于线粒体内膜的外表面,因此它的含量应该与细胞内线粒体含量有关,细胞内线粒体含量高,sarcomeric mito-CK含量随之增高。新生儿线粒体占细胞内体积的16%,而成人线粒体占细胞内体积的33%,新生儿线粒体占细胞内体积不足成人的一半,可以推测新生儿线粒体内的sarcomeric mito-CK也相应减少,因此,可以认为本实验REP电泳分离CK同功酶组成未见sarcomeric mito-CK条带是因为乳鼠线粒体及sarcomeric mito-CK含量少,因此在分离时未显示条带,同时,AngⅡ及黄芪组分配伍对sarcomeric mito-CK的mRNA表达的影响也缺乏特异性。


  2.2 本研究观察到AngⅡ对ATP合成酶F1亚单位β肽表达从增强到抑制的影响过程及黄芪组分配伍的保护作用,但未观察到对ATP合成酶活性的影响,对ATP含量的影响也不是相应的从增加到减少的过程,而是24h无影响、48h增加的过程。分析未观察到对ATP合成酶活性影响的原因,可能与本次实验中采取反复冻融法破碎心肌细胞以及检测的是整个心肌细胞的ATP合成酶活性有关。镜下观察反复冻融法破碎心肌细胞发现,相同的冻融条件下细胞的破碎程度不尽相同,推测提取的细胞内物质的量就可能存在差别。虽然ATP合成酶主要存在于心肌细胞的线粒体中,监测整个心肌细胞的ATP合成酶活性其实质就是监测线粒体ATP合成酶活性,但是不能排除细胞内其他物质对ATP合成酶活性检测过程的干扰。因此,进一步研究应提取培养心肌细胞的线粒体,检测线粒体ATP合成酶活性。本实验观察到的对ATP含量的影响显得相对滞后,这可能与ATP从合成到利用以及与PCr之间转换的复杂性有关,进一步研究应将观察时点延长至72h或更长一些,同时观察PCr含量的变化。


  2.3 既往的药理研究认为黄芪皂苷类有明显的抗病毒、抗缺血再灌注损伤以及正性肌力作用,更多地用于病毒性心肌炎、冠心病及心衰的治疗;而多糖类则具有明显的免疫调节功能,更多地用于肿瘤疾病的免疫调节。但是,本次实验观察二者对肥大心肌细胞能量代谢的干预作用,未见二者的明显差异,也未见有明显的协同作用。提示目前我们对黄芪的研究还存在缺陷,对黄芪有效成分的分离还需进一步细化。本研究中将黄芪注射液中黄酮、氨基酸、微量元素作用的忽略,也可能影响了部分观察结果。


  AngⅡ可引起心肌细胞ATP合成酶、CK同功酶表达的变化以及CK同功酶活性和ATP含量的变化,说明它能够诱导心肌细胞能量代谢相关酶的变化从而导致能量代谢的障碍,黄芪组分配伍可以在一定程度上抑制AngⅡ的作用,说明黄芪可以介入心肌细胞能量代谢,起到保护心肌的作用。


3. 黄芪注射液对肥大心肌细胞能量转运的影响

  黄芪注射液是从补气药的代表药——黄芪中提取的有效成分制成的,是防治心血管系统疾病的有效药物之一。心气虚证和心肌能量代谢障碍伴随CHF发生发展的始终,存在一定的共通之处。既往的研究者也发现黄芪对心肌细胞能量代谢有一定的改善作用。本实验研究则在前期实验的基础上,运用AngⅡ刺激心肌肥大,给予黄芪注射液或络沙坦进行干预,观察肥大心肌细胞的能量转运体系变化情况,探讨黄芪注射液治疗CHF的分子和细胞学机制。结果发现:


  3.1肥大心肌细胞的MMP较正常心肌细胞明显下降,而在络沙坦或黄芪注射液的干预下此变化不明显;


  3.2 ANT1在肥大心肌细胞中的mRNA表达是呈下降趋势的,黄芪注射液有维持其水平的作用;


  3.3心肌细胞肥大后总CK活性持续下降,而络沙坦和黄芪注射液可维持CK活性;


  3.4心肌细胞肥大后CK B亚基的mRNA表达和CK-BB所占比例在总CK中所占比例持续上升,同时伴随M亚基的表达和CK-MM所占比例的下降,而黄芪注射液则可以恢复CK各亚型的mRNA和蛋白的表达水平的平衡,维持CK总活性。而络沙坦可以降低B亚基的mRNA表达水平,升高CK-MB的比例,保持CK活性正常。


  通过上述临床研究的系统评价和实验研究,我们推断,黄芪注射液可以帮助提高CHF患者心功能,其机制与稳定能量物质转运酶系和MMP有关,而其对酶系的调控位点可能部分是在基因转录和翻译水平。黄芪注射液的最主要的有效成分被认为是黄芪皂苷,后者在改善心肌能量代谢方面可能是一种值得深入研究的药物。


  用益气法拮抗心肌细胞由肥大向衰竭的发生发展的机制与改善心肌能量代谢尤其是能量物质转运有着密切的关系,进一步发掘益气药物的相关有效成分和深入研究其作用机制和药代动力学特点,可能是发现新的心肌能量代谢药物的契机,同时在CHF的临床治疗中应重视益气法的使用。


4. 益气药对慢性心力衰竭大鼠心肌能量代谢的干预作用

  4.1益气药物对CHF模型大鼠心肌能量代谢的影响

  4.1.1益气药物对CHF模型大鼠心肌能量物质含量的影响

  当前研究认为心衰实质上是由于能量不足造成基因表达异常而引起的一种超负荷性心肌病。心脏收缩、舒张功能的减退与心肌能量代谢障碍相伴随,发生AMI后心肌缺血缺氧,有氧氧化中断,葡萄糖无氧酵解增强,氧化磷酸化产能减少,高能磷酸化合物迅速耗竭,底物水平磷酸化产能增加,能量产生不足引起心脏功能下降,并最终导致CHF;同时血流动力学负荷增加、神经体液激素激活、心肌功能丧失等使心肌负荷增加,心肌能量消耗过多加速CHF进程。


  心室重构是CHF时主要病生理改变,心室重构是在心肌缺血的基础上,由一系列复杂的分子和细胞机制导致心脏结构、功能、表型的变化,临床表现为心肌重量、心室容量的增加和心室形态的改变。心室重构使单位重量的心肌毛细血管数目减少,氧的弥散间距增大,故心肌缺氧;衰竭心肌中ATP酶的活性降低,使心肌能量利用发生障碍,进而心肌收缩功能减弱;缺血缺氧、能量不足及酸中毒引起心肌细胞死亡,心肌细胞死亡导致心脏纤维化,从而加重心室重构。因此,心肌能量代谢重构不仅是HF早期收缩力降低的机制之一,也是心肌纤维化,心室重构的重要因素。


  前期研究中我们发现:在不同时间点,模型组Cr含量均显著低于假手术组,表明模型组大鼠心肌中能量物质含量显著下降;伴随能量物质的减少,心功能明显减低,并且统计结果表明心脏收缩、舒张功能与能量物质的含量正相关,心肌能量物质是维持心脏正常功能的保证。心肌能量物质逐渐消耗,最终能量耗竭导致CHF。


  本实验结果显示:3周CHF模型组心肌能量物质PCr含量较假手术组降低,各用药组均较模型组有所升高,但各组间差异均无统计学意义;模型组心肌γ-ATP、α-ATP、β-ATP含量较假手术组略有降低,各组间差异均无统计学意义,表明3周时心肌能量储备物质PCr含量已出现下降,而直接供能物质ATP含量基本正常,因此3周时CHF模型大鼠未出现明显心衰症状,心功能基本正常。9周CHF模型组PCr含量较假手术组显著降低,各用药组PCr含量均较模型组显著升高;9周模型组γ-ATP、α-ATP、β-ATP含量较假手术组显著降低,各用药组心肌γ-ATP、α-ATP、β-ATP含量均较模型组显著升高,其中以党参组、黄芪组最为显著,各组间无显著性差异,但党参+黄芪组、联合用药组对ATP的改善均稍弱于单用党参或黄芪,其原因考虑与相同作用通路或作用靶点竞争有关,因此在临床运用中除了药物种类以外,中药通过配伍可能起到更佳效果。


  既往研究也表明,在发生严重心衰前,心肌ATP水平保持正常,严重心衰时显著下降;PCr和总肌酸水平在较早期阶段就下降,而且幅度较大(30%-70%)。结合本实验设计,CHF发展过程中心肌能量物质含量的变化符合CHF的病理特点。益气药物可以明显延缓心肌能量物质PCr及ATP含量的下降的速度,通过维持心肌直接供能物质ATP水平和能量储备物质PCr水平从而保证心肌收缩舒张所需能量的供应,从而改善心功能,延缓慢性心衰的发生和发展,其机制可能与心肌能量代谢调控机制的改变有关。


  4.1.2益气药物对CHF模型大鼠心肌能量代谢调控机制的影响

 心肌的能量代谢过程大致可分为能量的合成、储存和传输利用三个阶段,CHF发生发展过程中这三个阶段都会发生异常改变。在心肌能量储存和利用过程中最重要的是腺苷酸转位酶(ANT)酶系和肌酸激酶(CK)酶系。


  ATP是细胞进行生命活动的直接能量供给者,它在线粒体中主要通过氧化磷酸化产生后,不能通过自由扩散通过线粒体膜,必须先由位于线粒体内膜的ANT转运到胞质才能被细胞利用。ANT将线粒体合成的ATP转运至膜间隙,同时,催化线粒体外的ATP合成原料ADP转入线粒体基质,从而确保线粒体能量转换的顺利进行。有研究表明心肌肥厚早期ANT的表达无明显变化,而HF时其mRNA表达持续下降。在大鼠和小鼠组织中有ANT1和ANT2两种异构体,有研究表明,急性缺氧时,ANT活性与线粒体内ATP含量同时降低;在缺氧后期,ANT1 mRNA表达水平下降,而ANT2 mRNA表达水平升高,故其表达水平的增加对于改善能量的状态可能更为有利。


  ATP是能量的携带者和转运者,而能量的储存者是PCr。当ATP合成迅速时,位于线粒体内膜外侧的mi-CK催化ANT转运到线粒体膜间隙的ATP转移末端高能磷酸基团给肌酸生成PCr,穿过线粒体外膜,进入胞质,从而使ATP处于相对稳态水平;另外3种CK,包括CK-MM、CK-BB和CK-MB,位于胞质内,催化PCr转出高能磷酸基团给ADP,从而生成直接供能物质ATP。研究表明,发生HF时,mi-CK和CK-MM水平下降,而CK-MB、CK-BB比例增加,导致PCr和ATP之间的能量转化发生障碍。


  ANT和CK这两个酶系功能的正常是心肌能量传输的保证。而HF发生时,这两个酶系的功能和构成都会发生改变。


  3周模型组ANT1 mRNA表达较假手术组明显降低,ANT2 的mRNA表达较略有升高;9周模型组ANT1 的mRNA表达较假手术组明显降低,各用药组较模型组均有显著回升,其中西药组、黄芪组、联合用药组最为明显;模型组ANT2 mRNA表达较假手术组明显降低,各用药组较模型组均有显著回升,以党参组、黄芪组、党参+黄芪组及联合用药组最为明显。ANT及mi-CK共同实现能量由ATP转化为PCr的过程,本实验由于条件所限未进行ANT蛋白检测,从mRNA表达的结果来看,各用药组均能对ANT基因表达产生影响,从而逆转模型组产生的不利改变,增加心肌能量储备物质PCr的含量。


  3周CHF模型组CK-B亚基mRNA表达较假手术组升高,CK-M亚基mRNA表达下降,mi-CK亚基mRNA表达下降;同时,模型组CK-MB蛋白表达较假手术组明显降低,CK-MM蛋白表达降低,CK-BB蛋白表达升高,mi-CK蛋白表达降低;模型组总CK活性较假手术组明显降低。3周时各用药组均有延缓模型组改变的趋势,但仅有联合用药组对CK-MB蛋白表达有明显升高,并同时提高了总CK活性。


  9周时,模型组CK-B亚基mRNA表达较假手术组明显升高,CK-M亚基mRNA表达显著降低,mi-CK的mRNA表达与假手术组无明显差异;同时,模型组CK-MB蛋白表达较假手术组降低,CK-MM蛋白表达降低,CK-BB蛋白表达显著升高;mi-CK表达降低;模型组总CK活性较假手术组明显降低。9周时各用药组CK-M基因表达明显升高,CK-B基因表达明显降低,但由于对有利基因CK-M的升高作用和不利基因CK-B的降低作用力度不同,仅党参组、黄芪组及联合用药组较模型组明显升高了总CK活性。


  实验结果表明:CK同工酶中,胚胎期表达水平高的CK-B亚基的mRNA表达持续上升,而CK-M亚基则下降,CK同工酶组成发生了胚胎型改变。CK-MM的内在活性与CK-BB基本相同,在肥大增生期上能维持总CK活性,而到了衰竭期则最终会导致活性下降,引起能量物质转运发生障碍。研究表明,CK的胚胎型转化不会使ATP合成减低得到改善;从心肌肥厚到HF的过程中,CK总活性在出现HF时方出现显著下降。既往研究有关mi-CK mRNA表达因物种有所不同,心梗后大鼠心肌细胞CK总活性明显减低,CK-B亚基的mRNA表达升高而CK-M亚基的mRNA表达水平降低,而mi-CK 的mRNA表达水平没有发现明显变化。益气药物可以明显改善由于心气虚导致的慢性心衰心气虚证CK同工酶胚胎性变化,能够下调CK-B亚基的mRNA表达同时上调CK-M亚基,从而使CK同工酶和ANT两个酶系统处于相对稳态,抑制心肌细胞能量代谢重构,进而延缓了心衰的发生和发展。


  其他研究还观察到:从心肌细胞肥大开始,CK就开始发生胚胎化并最终会导致活性下降,引起能量物质转运发生障碍;黄芪组分及其配伍能显著对抗AngⅡ引起CK-B表达增加和CK-M表达减少,使心肌细胞的CK-B和CK-M亚基的表达趋于正常,在分子水平上干预细胞能量代谢预防心衰的发生发展。


  4.2 益气药物对CHF模型大鼠血流动力学的影响

  本实验将导管经颈动脉插入模型大鼠左心室,通过生理信号处理系统进行血流动力学检测。我们的前期实验结果显示:与假手术组相比,6周以后模型组大鼠左室收缩压明显降低,左室±dP/dtmax明显降低,左室舒张终末压明显升高。收缩压和+dP/dtmax反映左心室收缩功能,-dP/dtmax和左室舒张终末反映左心室舒张功能,因此,CHF模型大鼠左心室收缩舒张功能明显下降,符合现代医学心力衰竭的认识。


  另外,通过观察CHF模型大鼠的心脏,我们发现,模型组大鼠的心脏在早期(3周内)出现增大,左室扩大明显,而左室室壁苍白,但无明显塌陷;同期假手术组大鼠的心脏无明显扩大,仅在结扎位点附近可出现小部分心肌变白;6周以后模型组大鼠的心脏可继续扩大,左侧室壁明显塌陷变薄,颜色苍白;坏死心肌范围可扩展至室间隔、心尖部;同期假手术组大鼠心脏基本恢复正常。


  本实验中施加药物干预,结果显示:3周CHF模型组大鼠收缩压及+dP/dtmax较假手术组降低,-dP/dtmax降低及左室舒张终末压显著升高,表明在造模后模型组大鼠心功能已经出现下降,但结合前期实验及既往研究,考虑此时出现的心功能下降可能与手术创伤造成急性心衰有关。各用药组左室±dP/dtmax较模型组均有升高,其中西药组与模型组无显著性差异,考虑西药ACEI可能在早期对心脏功能的恢复作用不及中药仪器治疗效果显著;黄芪组改善±dP/dtmax效果最为明显,可能与黄芪在发挥益气作用同时兼有保护心肌作用有关;而党参+黄芪组、联合用药组效果较黄芪组偏弱,推测可能原因为补气药党参、黄芪有发挥作用的共同通路或靶点而导致相互竞争,具体原因尚待进一步研究。9周CHF模型组大鼠收缩压、左室±dP/dtmax较假手术组降低,此时因手术操作等原因影响很小,CHF模型大鼠心功能进入失代偿期;各用药组左室±dP/dtmax较模型组显著升高,与假手术组均无显著性差异,但除联合用药组外其他各组舒张终末压均明显高于假手术组,以上结果说明通过药物干预,西药及益气中药党参、黄芪均能延缓心功能由代偿期转为失代偿期的进程,而由于结扎冠脉造成心肌损伤引起的舒张终末压升高各单用药组均不能明显改善,联合用药具备优势。


  综上所述,通过血流动力学检测,CHF心气虚证大鼠模型出现了明显的心脏收缩、舒张功能障碍,益气药物和西药均可改善左室收缩和舒张功能,并且实验结果显示早期应用黄芪治疗对收缩、舒张功能的改善最为显著,益气治疗可以明显延缓慢性心衰发展的进程,联合运用党参+黄芪+西药对左室舒张终末压的改善更为显著。本实验所采用的有创血流动力学检测的方法是CHF模型心功能判断的“金指标”,±dP/dtmax下降50%即可判断为心衰;然而这一方法很难长期、动态观测,随着小动物超声的逐渐发展,通过超声心动对模型动物心功能进行检测的方法更为先进;但小动物超声对室壁运动减弱较为敏感,在心衰的判断上仍有待进一步完善。


  4.3 益气药物对CHF模型大鼠心气虚证症状的影响

  左心室舒缩功能异常是心气虚证心主血脉功能异常的标志。研究表明,左室收缩功能对心气虚的诊断有高特异性(88%),而舒张功能则有高敏感性(87%),心气虚证与左室收缩和舒张功能异常有共通之处。从中医病因和病机上讲,CHF造模过程手术创伤伤血耗气,结扎冠状动脉则导致心脉闭阻,“气为血之帅”,气虚加重血瘀;后期在此基础上通过游泳“劳则伤气”,加重气虚,因此气虚血瘀模型符合中医理论。


  前期研究和本实验中我们对CHF模型大鼠进行了八纲辨证和气血脏腑辨证的中医证候诊断,并采用中西医结合学会制定的临床虚证诊断标准中心气虚证和血瘀证诊断标准对动物模型进行证候评价。


  心悸可表现为心率快或心率不齐,计数心率可以部分表示心悸的情况。前期研究结果显示3周时模型组与假手术组无显著差异,第9周及以后模型组心率显著加快,存在显著性差异;本实验结果各组间心率未见明显差别,考虑可能原因为实验周期变短心功能失代偿尚不明显,故心率加快表现不明显所致;此外,条件所限本实验未对心律失常进行检测,随着小动物心电遥测技术的发展,通过心电遥测进行心率、心律失常的综合评价可能更具说服力。


  乏力气短源自患者的主诉,实验中通过检测力竭游泳时间来反映模型大鼠乏力气短的症状。3周时模型组力竭游泳时间较假手术组缩短,各用药组较模型组延长,但各组间差异均无统计学意义;9周时模型组游泳时间明显缩短,各用药组均明显延长,各组间有显著性差异,其中“党参+黄芪组”游泳时间延长最为明显,优于其他治疗组,与模型组无显著性差异,表明大剂量益气药治疗对改善心气虚证乏力、气短症状效果更为显著。


  此外,通过对毛发、活动情况、精神状况及抓取时反应情况的对比观察,与假手术组大鼠相比,模型组大鼠表现为毛发枯槁、倒竖,萎靡、喜静喜蜷缩易惊,抓取时反抗轻微等神疲的表现,另外的实验还表明该模型学习认知能力差,并与心功能的恶化程度成正相关,说明CHF模型大鼠同时出现了神疲等心主神明功能的下降。


  通过药物干预,各用药组精神及活动状况均有所改善,力竭游泳实验结果表明CHF模型组大鼠较假手术组缩短;各用药组大鼠力竭游泳时间较均较模型组延长,3周各组间差异无统计学意义;9周各用药组鼠力竭游泳时间较均较模型组明显延长,其中党参+黄芪组效果最为显著。表明益气药物可以改善由于心气虚导致的慢性心衰心气虚证气短乏力的症状。


  有研究发现黄芪皂苷可提高心肌ATP的含量,抑制氧自由基生成阻止膜脂质生成脂质过氧化物,减轻氧自由基引起的心肌损伤。

 

  益气药物可以维持心肌能量物质含量及能量调控机制的稳定性,延缓心肌能量代谢重构,进而改善心脏收缩和舒张功能,最终改善心血管病心气虚证症状,可能是中医气血理论治疗心气虚证的基础之一。


    2020/6/26 14:17:48     访问数:118
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