遗传性小管间质肾病:新技术带来新突破

病例介绍

  这个家系的先证者,是一个 53 岁汉族女性,因发现肾功能异常 7 年于 2013 年 2 月收入我科。患者既往有高血压病史。


  实验室检查显示患者 SCr 为 161 μmol/L,UA 475.5 μmol/L。尿常规:蛋白 ±,尿沉渣镜检阴性。24 小时尿蛋白 0.22 g。血清 ANA、ANCA 等免疫指标均正常。肾脏超声和 MRI 显示双肾大小正常,可见皮髓质多发的小囊肿。


  肾活检病理显示免疫荧光为阴性。肾小球为缺血性硬化或基本正常,肾小管萎缩,肾间质可见多灶状纤维化。肾小动脉壁轻度增厚。病理诊断为慢性小管间质肾病(图 1)。


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图 1 先证者肾脏病理表现:

(A)弥漫间质纤维化(Masson 染色);

(B)肾小管萎缩伴肾小管基底膜增厚(PASM 染色);

(C)肾小球基本正常(PAS 染色)。


  同年,先证者 29 岁的儿子也因肾功能异常,超声示双肾多发小囊肿,行肾活检病理检查同样诊断为慢性小管间质肾病。


家系调查

  在询问病史过程中,得知先证者的父亲、两个哥哥都因尿毒症去世,1 个姐姐在进行透析治疗,于是我们对这个家系进行了调查,包括五代共 137 人。家系中已有 18 人死于尿毒症或其并发症,3 人正在透析治疗。家系调查结果显示此家系的疾病为常染色体显性遗传(图 2)。


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图 2 家系图


基因检测

  常染色体显性遗传性小管间质肾病(Autosomal dominant tubulointerstitial kidney disease,ADTKD)是一类表现为常染色体显性遗传的慢性肾小管间质疾病。2015 年改善全球肾脏病预后组织(KDIGO)发表了 ADTKD 诊断、分类和管理的专家共识,明确此病为单基因突变所致的遗传性疾病。延伸阅读:KDIGO 常染色体显性小管间质性肾病诊断、分类和管理 | 指南巡礼  根据致病基因不同,KDIGO 将 ADTKD 分为 ADTKD-UMOD、ADTKD-MUC1、ADTKD-HNF1B 和 ADTKD-REN 等 4 个不同类型,最近有研究发现 SEC61A1 基因的突变也可导致 ADTKD。


  通过全外显子测序方法,我们证实先证者 UMOD、REN、HNF1B 及 SEC61A1 基因均无突变。由于 MUC1 基因的突变位点主要发生在可变数目串联重复序列(variable number tandem repeats, VNTR)区域,此区域包含以 60 个核酸为单位的重复序列(不同个体重复 20-125 次不等),而突变仅发生在其中一个重复单位中;且此区域 GC 含量极高(接近 90%),常规的 Sanger 测序及全外显子测序均难以检测到此区域的突变,故导致 ADTKD-MUC1 的基因诊断极为困难。


难点:SMRT 显神威

  本研究中,我们选择单分子实时(long read single molecule real time,SMRT)测序技术进行 MUC1 VNTR 片段的检测。SMRT 测序也称为第三代测序技术,具有单分子测序和超长读长的特点。通过 SMRT 测序,我们发现了先证者 MUC1 基因 VNTR 区域的第二个重复序列中,正常的连续 7 个胞嘧啶(7C)后插入了一个异常的胞嘧啶,变为连续 8 个胞嘧啶(7C→8C)(图 3)。这一插入突变导致转录后的 MUC1 mRNA 在翻译时出现移码,并产生全新的移码突变蛋白(MUC1 frame shift protein, MUC1fs)。


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图 3 先证者的MUC1基因突变位点


佐证:肾组织及尿脱落细胞的 MUC1fs 染色

  为进一步验证这个家系基因异常者体内确有异常突变蛋白 MUC1fs 的产生,我们自行制备了 MUC1fs 的兔抗人多克隆抗体,并对先证者肾组织中肾小管上皮细胞及尿脱落细胞进行了 MUC1fs 的染色,结果显示两种细胞的胞浆中均有 MUC1fs 的表达,免疫荧光染色为阳性(图 4,图 5)。


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图 4 先证者肾小管上皮细胞 MUC1fs 免疫荧光染色。

(L)肾小管上皮细胞 MUC1fs 染色(红色);

(M)肾小管上皮细胞 CK19 染色(绿色);

(N)荧光染色图片融合。


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图 5 先证者尿脱落细胞 MUC1fs 免疫荧光染色。

(A)尿脱落细胞 MUC1fs 染色(红色);

(B)尿脱落细胞 CK19 染色(绿色);

(C)荧光染色图片融合。


最终诊断

  结合肾脏病理、家系调查和基因检测结果,本家系被诊断为常染色体显性遗传性小管间质肾病 MUC1 型(ADTKD-MUC1)。


随访

  之后,我们对家系中 28 名成员进行了 5 年的随访。5 年中家系又有 3 人进入透析,1 人出现肾功能异常,目前有 6 名携带者尚未发病。基因携带者发生肾功能不全的年龄在 35 岁以上(中位年龄 46 岁),进入肾衰竭的中位年龄为 52.5 岁。基因携带者的血尿酸水平明显高于非基因携带者,但均无痛风发作。基因携带者中基线尿 α1 微球蛋白更高者在随访中肾功能下降更显著。


讨论

  ADTKD 是一种罕见的常染色体显性遗传性疾病,既往国外文献报道,其临床表现无特异性,遗传家系之间异质性较大。往往表现为尿中无或轻度蛋白尿,无尿红细胞,肾功能逐渐进展,部分患者可伴有肾脏多发囊肿等。肾脏病理表现为慢性间质小管病,肾小管萎缩和小管间质纤维化。目前认为 ADTKD 中的 MUC1 基因突变的类型并不少见,发病率仅次于 ADTKD-UMOD,但国际上报道的家系并不多,且主要集中在欧洲裔或欧洲美国裔,其余为澳洲、非洲美国裔、中东等。在国内,由于 MUC1 基因检测的困难而鲜有患病家系被发现。


  本家系为目前发现的中国最大的 ADTKD-MUC1 家系,我们应用 SMRT 测序技术有效的检测出患者 MUC1 基因的突变位点。在肾小管上皮细胞和尿脱落细胞中进行突变蛋白 MUC1fs 的检测进一步明确了 ADTKD-MUC1 的诊断。通过对本家系的临床检测和 5 年的随访,总结出该家系的一些临床特点,可以为我们初筛 ADTKD-MUC1 患者提供有价值的线索。


  此外,利用 MUC1fs 抗体进行尿脱落细胞染色,不失为一种简单有效的 ADTKD-MUC1 家系筛查方法。利用这种方法,可以更快速地对临床怀疑为 ADTKD-MUC1 的家系进行初步的筛查。


  来源:肾内时间


    2020/6/1 9:56:23     访问数:84
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