外阴阴道假丝酵母菌病模型大鼠阴道局部免疫调节的变化

目的

  通过建立外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)大鼠模型,研究VVC感染的疾病过程及不同治疗后阴道上皮的免疫修复情况以及阴道上皮细胞超微结构的变化。


方法

  使用雌性SD大鼠建立VVC模型,并分别予不处理(模型对照组)、制霉菌素(制霉菌素组)治疗、中成药康妇消炎栓治疗(康妇消炎栓组),每组6只。对阴道上皮行透射电镜观察和免疫组化染色,观察上皮细胞超微结构的变化以及细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)4、IL-17、IgG在上皮细胞中的表达情况。


结果

  模型对照组大鼠的病原体转阴率为0,制霉菌素组转阴率为6/6,康妇消炎栓组为5/6,3组比较,差异有统计学意义(P=0.015)。透射电镜下可观察到VVC感染后的阴道上皮细胞出现明显的结构破坏,而制霉菌素、康妇消炎栓治疗后的上皮细胞结构基本恢复至正常状态。免疫组化染色结果显示,康妇消炎栓组4种细胞因子中发挥免疫保护作用的IFN-γ、IgG表达升高,分别与正常对照组、模型对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),与制霉菌素组比较,差异无统计学意义(P>0.05);制霉菌素组IL-17的表达增高,而康妇消炎栓组IL-17的表达下降,两组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。


结论

  VVC感染后阴道上皮细胞的超微结构会发生明显的损伤变化,阴道局部免疫状态失调,抗真菌药物制霉菌素对于VVC有良好的治疗作用,可显著修复VVC感染后受损的阴道上皮结构,并可加强阴道上皮局部的免疫保护作用;中成药康妇消炎栓表现出与制霉菌素相似的治疗作用。


讨论

  本研究成功建立了VVC大鼠模型,应用透射电镜及免疫组化的方法,比较VVC感染及制霉菌素或康妇消炎栓治疗后的不同时期阴道上皮细胞超微结构以及阴道局部免疫状况的变化,同时探索了中成药应用于VVC治疗的可行性。


01 VVC感染状态及有效治疗后阴道上皮细胞超微结构的变化

  本研究显示,模型对照组大鼠的病原体转阴率为0,说明机体一旦感染VVC,一般情况下很难凭借自身的免疫抵抗力清除感染,会发展为持续感染状态。制霉菌素组的转阴率为6/6,制霉菌素治疗后病原体全部转阴,证实其具有良好的抗真菌作用;而康妇消炎栓组在康妇消炎栓治疗后转阴率可达5/6,证实康妇消炎栓同制霉菌素治疗效果相似,说明阴道给药可以较好地治愈VVC感染,康妇消炎栓对VVC感染同样有较好的治疗效果。


  有研究表明,VVC患者常见的阴道黏膜红肿、灼痛、性交痛等症状与VVC感染时病灶局部的微循环异常有关,阴道组织局部毛细血管的管径、血流灌注、红细胞聚集率及水肿状态作为有效反映局部微循环的重要指标,在VVC患者中均呈现较差的状态[4]。可以推测,在细胞超微结构层面同样会出现相符的病理性改变。本研究在透射电镜下观察模型对照组大鼠的阴道上皮细胞,可见最为特征性的改变是细胞桥粒数量和结构的明显异常,连接结构破坏明显,上皮细胞之间无法正常紧密连接。


  细胞连接的破坏会直接影响细胞的屏障隔离作用、传导通讯作用等一系列重要的作用,直接影响阴道上皮结构的整体生理功能,出现相应的临床症状。这说明,VVC的感染不得到纠正和治疗,可能会破坏上皮细胞的结构根本,影响阴道上皮正常的生理功能和微循环灌注。


  制霉菌素是1种多烯类抗真菌药,具有广谱抗真菌作用,其作为膜渗透性增强剂,可通过与真菌细胞膜的固醇类物质结合增加细胞膜通透性,使细胞的重要内容物及K+外移而抑制其生长,发挥抗真菌作用;作为临床上常见的经典抗真菌药物,适用于机体多种部位的真菌感染性疾病,在女性生殖道感染方面主要应用于VVC感染,国内也有研究表明,应用于细菌性阴道病的治疗同样可取得较好疗效。制霉菌素可改善阴道上皮的病理状态,经其治疗后的大鼠阴道上皮呈现明显的修复愈合性变化,验证了制霉菌素良好的抗菌抑菌及阴道局部修复的功能。同时本研究发现,康妇消炎栓治愈的大鼠阴道上皮细胞结构未见明显异常,同样可达到类似制霉菌素的修复作用。康妇消炎栓是由苦参、穿心莲等8味中药组成,具有清热解毒、利湿散结、杀虫止痒的功效,目前临床多应用于治疗慢性盆腔炎,也有用于子宫颈炎的联合用药,均可取得较好疗效,其含有的芦荟、地丁可加速阴道黏膜的修复。


02 VVC疾病发展以及药物影响下阴道局部免疫调控机制的变化


  1.阴道上皮抗白假丝酵母菌的细胞免疫功能:

  白假丝酵母菌是VVC最主要的致病菌。VVC的发病机制十分复杂,主要有致病菌毒力和宿主两方面的原因,但临床上单一延长抗真菌药物的使用时间并不能阻止其复发。早有证据显示,VVC的发生与阴道局部免疫功能紊乱相关。白假丝酵母菌可以刺激阴道细胞产生多种细胞因子,而阴道局部的细胞免疫在宿主抗白假丝酵母菌过程中发挥了重要作用。细胞免疫主要由Th1和Th2细胞介导。通常认为,Th1细胞可激活巨噬细胞和中性粒细胞,增强吞噬杀菌作用,发挥抗真菌功能,起到免疫保护作用。而Th2细胞通过介导体液免疫反应,产生抗炎细胞因子,在过敏反应中起主导作用,并可抑制Th1细胞应答,增加易感性。正常情况下机体内的Th1与Th2细胞彼此拮抗,处于动态平衡,一旦由于外界因素的影响打破此平衡而出现Th1或Th2优势状态,可能诱发过度免疫或病原体感染状态,表现为Th1/Th2漂移。作为Th1 类细胞因子的代表因子,IFN-γ 在VVC感染后表达升高,提示Th1类细胞因子在VVC感染状态时分泌增加,可促进正性免疫保护作用的加强,抵御假丝酵母菌的侵袭,与国外报道的结果[4]一致。而制霉菌素治疗后也显著上调IFN-γ的表达,提示制霉菌素在VVC感染时可使Th1细胞的正性调控作用持续化,维持Th1细胞的免疫保护作用,发挥抗真菌功能。康妇消炎栓表现出了同样的趋势,同样具有促进Th1细胞免疫保护的作用。


  IL-4是细胞免疫中Th2细胞分泌的代表性的细胞因子,而Th2细胞的主要作用为介导体液免疫应答,产生促炎因子并诱发过敏反应,增加感染的易感性。目前的多数研究认为,IL-4促进Th0细胞分化为Th2细胞,并抑制其分化为Th1细胞,同时可抑制单核巨噬细胞和中性粒细胞对假丝酵母菌的吞噬杀伤能力[5]。多数学说认为,IL-4在VVC的疾病感染过程中起负性调节作用。本研究中,IL-4在包括正常对照组的4组中的表达无明显差异,不能说明IL-4及Th2细胞在VVC感染中未起作用,更可能的原因是在VVC的转归和药物治疗的过程中已经发生了从Th2向Th1的漂移,阴道局部免疫状态再次向正性保护的平衡状态恢复。


  IL-17代表了新发现的Th17细胞介导的免疫应答反应,可加速中性粒细胞的募集和活化,介导促炎症反应。国外的动物实验表明,敲除了IL-17基因的小鼠感染白假丝酵母菌后肾内的载菌量升高,说明IL-17在真菌感染时起到免疫保护作用[6]。


  假丝酵母菌感染时,菌体表面的甘露聚糖、葡聚糖等成分作为病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns)识别免疫细胞表面的模式识别受体(pattern recognition receptor),如Toll 样受体、C 型凝集素受体等,通过一定的信号传导通路,激活Th17细胞。Th17细胞则分泌IL-17等细胞因子,通过募集中性粒细胞以及产生防御素、富组蛋白等抗菌肽,控制菌体过度增殖以及菌体酵母-菌丝的形态转化,从而对黏膜白假丝酵母菌感染发挥防御作用。本研究显示,仅制霉菌素组的IL-17表达出现明显上调,而康妇消炎栓组和模型对照组的IL-17表达均处于相对较低水平。IFN-γ和IL-4的表达结果可以推断制霉菌素和康妇消炎栓对VVC感染的阴道局部免疫保护的正性调控作用,而IL-17的表达未能进一步印证该结果。事实上,抗真菌免疫所涉及的免疫细胞、免疫分子以及调控途径是多方面的。本研究仅仅观察了药物对Th17、IL-17途径的影响,看似结果矛盾,但不排除其他免疫细胞、分子及途径的正性调控的保护作用。中成药复方具有多成分、多靶点、多效应、综合调节等特点,本研究组推测可能是康妇消炎栓的复方中某些组分下调了Th17细胞的数量或IL-17的表达水平,而其他组分通过正性调控来补偿甚至超出这种负性调控作用,从而在整体上发挥正性的抗真菌免疫调控效应,但具体的有效组分以及详细的免疫调控环节尚有待于进一步探讨。


  2. 阴道上皮抗白假丝酵母菌的天然免疫功能:

  传统理论认为,Ig主要由B淋巴细胞及浆细胞产生,作为体液免疫产生的特异性抗体,在机体抗感染过程中发挥中坚作用。而近年来的大量研究表明,非B淋巴细胞同样能够产生Ig,该类报道最早见于2003年[7-8]。目前的研究证实,在神经元细胞、角膜细胞、正常上皮细胞及上皮源性肿瘤细胞中均存在Ig的表达[9]。而阴道上皮细胞具有的天然免疫功能作为防御病原体感染的第1道防线,在抵抗白假丝酵母菌的侵袭中发挥着重要作用[10]。天然免疫是特异性免疫的基础,促进特异性免疫的形成,两者相互协同,在抗感染过程中加强免疫作用。牛小溪等[11]在2016年的体外研究中证实,正常阴道上皮细胞中表达IgG。同时,阴道上皮细胞还可产生不同的抗微生物肽,如富组蛋白、防御素等[12],目前对上皮源性IgG的相关研究有限。如果阴道上皮细胞分泌的IgG在天然免疫中扮演了重要角色,那么其变化对于女性生殖道感染的一系列免疫调控作用会影响重大。本研究结果表明,VVC感染时IgG表达明显下降,推测VVC感染时可能会抑制阴道上皮细胞自身的天然免疫应答作用,加速阴道上皮的病理变化;而制霉菌素治疗后IgG的表达明显上调,说明其有助于恢复IgG的表达,帮助恢复阴道上皮局部的天然免疫功能,发挥抗真菌效果;康妇消炎栓治疗后IgG的表达同样上调,推测其作用类似于制霉菌素,同样有助于恢复阴道上皮的天然免疫功能,发挥治疗作用。


  VVC对患者的生命质量会带来不同程度的负面影响,早期对VVC的研究停留在病原菌和传统抗真菌药物治疗方面,但研究表明治疗效果持续时间短、复发率高。目前,VVC与阴道局部免疫调控机制之间的关系越来越受到重视,但局部免疫在VVC中的具体作用机制还存在许多争论,尤其是相关药物治疗后阴道上皮细胞超微结构的变化以及局部不同免疫通路的调节改变,目前相关的研究并不多见。本研究表明,VVC感染后阴道上皮细胞的超微结构和阴道局部免疫状态会发生一系列明显的变化,制霉菌素作用于VVC模型大鼠有明显的治疗效果。初步研究表明,制霉菌素有良好的修复阴道黏膜上皮的功能,在VVC的免疫调控中上调Th1细胞的正性保护作用,调节Th1/Th2免疫平衡,促进分泌上皮源性IgG,发挥抗真菌作用。中成药康妇消炎栓含有的有效中药成分具有类似制霉菌素的抗真菌作用,对于VVC也有良好的治疗效果,两者均具有明显的修复阴道上皮结构的作用。然而本研究属于小样本量探索性实验研究,今后可扩大样本量,进行深入研究。


文章来源:妇产科空间


    2020/5/9 9:03:03     访问数:75
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