杜氏肌营养不良家系产前诊断一例

  孕妇31岁,孕2产1,2019年3月14日因“既往不良生育史”于妊娠12周于郑州大学第一附属医院就诊。既往有杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)患儿生育史。先证者男,5岁,汉族,否认产伤、窒息史,1岁3个月会走路;4岁出现进展性肢体乏力,行走缓慢,易跌倒,鸭步,上楼梯困难,渐加重至蹲起困难,双小腿增粗变硬。查体:营养中等,鸭步,Gower 征(+),双侧腓肠肌中度肥大,触之稍硬,双下肢肌力Ⅳ级。肌电图示肌源性损害,血肌酸激酶水平为12 500 U/L(正常范围:50~200 U/L)。临床诊断为DMD。无家族史。本次妊娠,孕妇要求行基因检测及产前诊断,评估此次胎儿的患病风险。


  孕妇签署知情同意书后,抽取先证者、孕妇外周血各2 ml,予乙二胺四乙酸抗凝。超声引导下抽取胎儿绒毛标本,采用PowerPlex 16HS试剂盒(瑞典Promega公司产品)排除母源性污染。按照DNA提取试剂盒(美国Omega BioTek公司产品)说明书提取DNA样本。采用荷兰MRCHolland公司多重连接依赖性探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)检测试剂盒检测先证者DMD基因的缺失或重复,结果为先证者79个外显子(探针覆盖区域)均有扩增。


  采用Ion torrent PGM 高通量测序平台(美国Thermo Fisher Scientific 公司产品)完成二代测序(next generation sequencing,NGS)检测,结果显示,先证者的DMD基因不存在点突变、微缺失或插入重复;但采用IGV软件分析显示,先证者DMD基因第19外显子无覆盖,测序深度为0,其他外显子的测序深度均约300×,提示,先证者DMD基因第19外显子无扩增。见图1。


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  分析MLPA试剂盒探针引物和NGS引物的覆盖区域设计荧光定量PCR技术引物,根据前两种检测发现的先证者DMD基因第19外显子的无缺失区域(D1区域)和缺失区域(D2区域)设计PCR引物,D1区域引物,上游:5′CGTGAT AAGCTGACAGAGTGAAACAT3′,下游:5′CTTTTTCTCGCT CTATGGCCTGCAG3′;D2区域引物,上游:5′TTGGAAGA AAATGGGATGTGGTAG3′,下游:5′ACAAAACAGGAATG ACGGTAAAAC3′,引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。按照文献报道的方法完成定量PCR技术检测,结果显示,先证者、孕妇和胎儿D1区域均为正常拷贝数,先证者D2区域无扩增产物,提示,先证者为该区域半合子缺失型DMD患儿;母亲和胎儿DMD基因D2区域拷贝数均为正常女性对照的一半,提示均为杂合缺失型携带者。见图2。通过DMD 基因内含子区4 个短串联重复序列(short tandem repeat,STR)的多态性位点进行连锁分析,母亲和胎儿在STR位点i45和i49均成杂合状态。其中胎儿来自母亲的X染色体,与先证者一致,提示,胎儿为携带者的可能性大,与荧光定量PCR技术检测的结果一致。告知产前诊断结果及进行遗传咨询后,孕妇选择继续妊娠,随访结果示胎儿为健康女性携带者,与产前诊断结果一致。


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讨论


  DMD也称假肥大性肌营养不良,为X连锁隐性遗传。DMD由DMD基因缺陷导致肌细胞膜上的抗肌萎缩蛋白功能异常,肌细胞受损伤,血肌酶谱肌酸激酶水平明显升高,出现肌肉进行性坏死、萎缩等,临床表现运动能力下降、步态异常、跟腱挛缩、腰椎前凸等变化,查体可见明显双腓肠肌假肥大现象。一般男性易发病,男性婴儿DMD的发生率为(20~30)/10万。我国DMD的发生率约为1/3 853,全国的DMD患者约70 000例。DMD基因位于Xp21.2~3,是已知人类最大的基因之一,互补DNA(cDNA)长14 kb,编码区包括79个外显子[7-8]。DMD患者中约1/3为新发突变,余为遗传性突变者;外显子缺失突变占55%~65%,重复突变占5%~10%,点突变占30%。临床疑似DMD的患者确诊时需行基因检测,首先采用MLPA技术检测DMD基因的大片段缺失和重复,60%~70%的患者可找到致病原因。而另外30%的DMD患者为由DMD基因点突变(无义突变、引起移码的突变、内含子与外显子剪接接头突变)导致的,则应采用NGS技术检测。NGS技术是近年新兴的通量高、敏感度高、速度快的测序技术,诊断DMD基因点突变时发挥了重大的作用。


  本例家系中,采用多种检测方法分析了1个DMD家系先证者的致病原因,并完成了对携带者的筛查和产前诊断。先证者的行动异常、血肌酸激酶水平异常、双侧腓肠肌假性肥大、Gower征阳性、腰椎前凸、翼状肩胛,符合典型的DMD临床表现。本家系先证者的DMD基因MLPA结果为阴性,NGS结果显示先证者的DMD基因不存在点突变、微小的缺失和插入重复,但经STR分析基因覆盖度和测序深度显示DMD基因的第19外显子无覆盖,测序深度为0,其他外显子的测序深度均为约300×。本例先证者的MLPA结果为79个外显子均无缺失,表明DMD探针覆盖区域无大片段缺失或重复,经PCR技术扩增验证后推测先证者DMD基因第19外显子下游及内含子区域存在部分缺失。同时应用荧光定量PCR技术和STR分析技术,对本家系成员进行DMD基因检测,结果提示先证者为区域缺失患儿,母亲和胎儿均为携带者。STR分析方便、快捷,但易因染色体重组而导致假阳性和假阴性结果的发生。在进行DMD基因大片段缺失、重复的检测中,单个碱基突变会显示DMD基因单个外显子缺失,导致假阳性结果的存在,所有单个外显子缺失者需要PCR技术进行验证。本家系MLPA的阴性结果提示,由于MLPA探针设计只能覆盖基因外显子的部分区域,会存在一定的漏检率。


  多种方法联合的检测及分析提高了DMD基因罕见突变的检测率,为遗传咨询和产前诊断提供了依据。


  参考文献:略


  来源:妇产科空间


    2020/4/10 15:15:15     访问数:145
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