干细胞移植治疗冠心病的临床应用问题

关键词:干细胞,冠心病,自体骨髓干细胞移植,心肌修复,第十次中西医结合

摘要:

   干细胞移植治疗是近年来冠心病治疗的一种新的治疗策略。随着国内外大量基础及临床实验结果的发布,已经显示出干细胞移植治疗令人鼓舞的成果。本文就干细胞移植临床应用的细胞来源、分化、存活、移植途径、安全性等问题进行阐述。为干细胞移植治疗冠心病的临床应用及进一步研究方向给予启示。

  

   冠心病的治疗是心血管疾病中的一个棘手问题,即使进行了血运重建,也不能完全解决由于冠状动脉多支和弥漫性病变引起广泛心肌缺血、坏死和纤维化而导致的心肌功能失常、心脏扩大,最终发展为心力衰竭。在发达国家,冠心病心力衰竭是主要的致死、致残的原因之一,心肌梗死后的症状性心衰患者5年死亡率高达50-70%,唯一有效的延长生命的方法就是心脏移植。而心脏移植受到供体来源和技术限制,无法广泛开展,新的改善预后及生存质量的治疗策略亟待开发。自1998年美国科学家首次提取出“胚胎干细胞株”后,生物学研究进入了干细胞时代,涌现出大量的基础及临床研究成果。其中,干细胞在冠心病中的应用成为了近年来临床研究的热点之一,一些临床前期的研究已经显示出干细胞移植治疗令人鼓舞的成果。目前,干细胞移植治疗的临床应用还存在以下几个主要问题:


1 
种子细胞的选择

   干细胞移植的种子细胞主要有胚胎干细胞、骨骼肌卫星细胞、骨骼肌成肌细胞、骨髓干细胞、外周血干细胞、心肌干细胞等。胚胎干细胞能分化为心肌细胞,但不易获取,存在伦理学问题,其应用的安全性还未克服,距离临床应用还有很大的距离[1]。骨骼肌卫星细胞数量很少,有丝分裂潜能随年龄增长而进行性下降,平滑肌细胞收缩慢,不能与宿主心肌形成缝隙连接。骨骼肌成肌细胞,此类细胞分化的心肌细胞不易诱导分化成熟,而且很快发生凋亡,分化的细胞可能引起心肌的电生理紊乱[2]

   此外,一些研究认为,心肌组织内存在自身的干细胞——心肌干细胞(cardiac stem cells CSCs),被注入冠脉循环后几小时内即可穿过血管壁进入心肌组织,分化为两种肌细胞,较大的肌细胞(具有成熟肌细胞特征)分布于梗死区的边缘和远处,而较小的肌细胞(分化较低)分布于梗死区,可有效的修复受损组织。但这种细胞的获得目前只能通过预先的心肌细胞收集和低温储存,临床应用较为困难。通过小的心肌活检并行体外扩增以取得细胞的方法尚在研究中[4]

   目前临床大量采用的是骨髓干细胞和外周血干细胞。外周血干细胞能在心肌梗死小鼠模型中分化为心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞。但是,正常情况下成人外周血干细胞非常稀少,只占单核细胞0.01%~0.10% ,是骨髓干细胞的1%~10% [3]。 而骨髓干细胞(bone marrow stem cells, BMSCs)应用有更多优越性,可较为容易的从成人体内获得,避免伦理问题,无自身免疫排斥反应。在心脏环境中,这些多能细胞可能横向分化形成心肌样细胞及血管内皮细胞。现有的主要移植方法为混合细胞移植和单一细胞成分移植。混合细胞移植即单个核细胞移植,这种移植方法具有操作简单、安全、不需体外扩增的优势,适宜于临床应用。但因为所含细胞成分相对复杂,研究具有局限性。另一种方法为单一细胞成分移植,目前关于骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)或造血干细胞移植的研究较多。大量研究显示,BMMSCs经体外诱导分化剂诱导后可以形成心肌样细胞,出现肌管样细胞、胞内肌丝样结构,免疫组化检测显示表达心肌细胞表型,与临近细胞形成缝隙连接[20、26],但这一方法需要进行体外培养扩增,培养基成分及诱导分化剂可能对细胞造成一定影响,而且在培养过程中可能造成细胞污染,其临床应用安全性收到质疑。

   最近,美国及日本的研究者同时发现细胞经过“基因直接重组(directreprogramming)” 技术后可以转化成为具有胚胎干细胞特性的细胞,称为诱导式多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)。这项发现解决了胚胎干细胞面临的伦理学问题,使得细胞来源更加广泛,被《科学》杂志评为2008年世界十大科技进展之首,如果解决其安全性和产生效率的问题,iPS将成为种子细胞的新选择[27]


2    
细胞定向诱导分化为心肌细胞的问题

   目前大多数研究所使用的细胞类型为骨髓间充质干细胞,经体外5-氮胞苷诱导后移植可以在疤痕组织中形成心肌细胞,并形成缝隙连接[5]。但其转化效率较低,且有细胞毒性作用,促进细胞的凋亡和细胞内细胞器的空泡样变性。关于BMMSCs定向诱导分化的研究较多,除了5-aza的定向诱导外,HGF体外诱导可使BMMSCs分化为有自律性搏动的细胞群。有研究表明BMMSCs与心肌细胞间的直接接触培养是关键因素,而心肌细胞分泌(单独分泌或与心肌细胞接触后分泌)的可溶性信号分子不能诱导BMMSCs分化为心肌细胞[6],而含有心肌细胞裂解成分的培养基可以诱导BMMSCs向心肌样细胞和内皮样细胞方向分化 [7]。心肌细胞分泌的各种细胞因子如内皮素( endothlin,ET) 、血管紧张素Ⅱ、TGFβ、胰岛素样生长因子Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)、去甲肾上腺素等在BMMSCs横向分化中也起着某种作用。但是BMMSCs分化为心肌细胞的具体机制仍然不是十分清楚,关于BMMSCs的横向分化在医学领域还存在很多争议。


3     干细胞进入疤痕区和在疤痕区的存活问

     心肌梗死区的组织修复是从周边向中心推进的,瘢痕组织内是血液供应最差的区域。干细胞要演变成心肌细胞,是一个持续分化、转变、增殖的过程,现有的移植方法,细胞不易存活及演变。研究显示,移植细胞在梗死组织中存活率极低,移植一周后的细胞存活率只有不到10%,其主要原因就在于心肌梗塞后坏死区心肌细胞和局部的微环境均受到破坏,缺血缺氧导致细胞存活率降低[21-23]。干细胞是否能在真正的瘢痕组织内存活、分化、生长尚待明确,如果不能,那么在梗死区内可以让干细胞安家落户的地方只能是梗死边缘有肉芽组织的区域。多项研究发现,植入的干细胞较多出现在梗死区边缘,且分化较疤痕内的干细胞较好[24]。而在肉芽组织区内出现的心肌样细胞和心肌细胞除需要作形态认定其具备心肌细胞的特征性结构外,还要鉴定细胞来源,目前发展较快的示踪技术在干细胞领域研究应用较多。


4 
干细胞移植通路的问题

   骨髓干细胞动员、选择性冠状动脉注射、静脉内注射、外科经心外膜直接心肌内注射干细胞、经心内膜注射干细胞、心肌补片、组织工程化心肌细胞支架、经激光打孔通道包埋干细胞等移植途径均有报道,然而没有证据表明哪种途径更适合干细胞的存活和定居。有研究显示在静脉注射、经冠脉注射、心内直接注射三种途径中,后者在安全性、耐受性等方面优于前者[25]。但经心外膜直接心肌内注射及经导航系统导管法心内膜注射为有创操作,技术难度大,有一定的手术风险,目前还不能普遍应用。目前大量临床研究多采用冠脉内注射方法,需球囊阻塞冠脉一定时间,可能加重心肌缺血,细胞悬液对冠状动脉也可能有阻塞作用[8、9]。此外,冠脉内干细胞移植是否增加支架内再狭窄问题还存在争议。有报道在急性心肌梗死行梗死相关动脉支架术后,经冠状动脉注射干细胞治疗使支架内再狭窄率增高[10]。虽然有这些争论,但近年来大量的临床研究显示了冠脉内干细胞移植的安全性,并没有其发现增加再梗及支架内再狭窄发生率。总之,冠脉内注射方法创伤小,操作较为简便,可以与经皮冠状动脉介入(PCI)血运重建治疗同期进行,随着PCI技术的普及,这种移植方法具有很强的可操作性。

   此外,我国传统中医药方法在干细胞骨髓动员方面的研究也有很大的进展,从补肾、益气、活血、温阳健心等理论发展出的方剂疗法显示出较好的骨髓动员效果[31-33]


5  干细胞移植的安全性问题

   有研究者认为,干细胞移植有可能导致心律失常发生[11、12]。实验发现来源于小鼠胚胎干细胞或胚胎瘤的心肌细胞能够分化成具有至少3种动作电位表型的心肌细胞,具有自发电活动,动作电位时程延长,易诱发触发性心律失常[13]。存活的移植细胞解剖排列紊乱,存在电生理异质性,与宿主细胞不能形成有效的电机械偶联,可能引起折返[14、15]。此外,细胞移植过程中的机械及炎症刺激可以引起一过性的心律失常,干细胞移植改变了植物神经的活性,使交感活性增加[16]。这些原因可能增加心律失常的发生。但也有研究显示,成体干细胞如BMMSCs作为非兴奋性细胞,可以与宿主细胞形成良好的电机械偶联,自身致心律失常可能性较小[17-19]。Makkar[19]同时总结6项小规模心肌梗死后BMMSCs移植临床试验共67例, 1例猝死, 2例发生室上性心律失常,均未安置ICD。同时,几个较大规模的临床研究(TOPCARE、REPAIR、BOOST TRIAL)显示,干细胞移植后恶性心律失常的发生与对照组相比没有明显差异[28-30]

   此外,干细胞移植后是否产生无法控制的细胞分化增殖,使室壁增厚、致瘤性等问题仍需证实。这些安全性问题均涉及供体细胞种类、诱导培养方法、移植方式、受体心脏自身病理状况等多因素,需更多大规模的研究进行评价。

   总之,干细胞移植是一种治疗冠心病的新方法, 通过改善微循环、促进细胞因子释放、增加心肌支持结构、对抗心肌细胞凋亡、挽救冬眠心肌细胞,修复受损心肌、有利于保存心脏功能。在移植的细胞中导入某些特异性的功能基因或细胞因子,调节植入细胞的存活和功能,是国内外研究的热点。中医药方法以其独特的优势展现了极大的应用前景,在细胞诱导、动员、存活、抗凋亡等方面均有应用成功的报道,值得我国学者进一步深入探索。

   目前,国内外已有多个临床研究证实干细胞移植治疗具有中等程度的疗效 [28-30]。Enca Martin-Rendon等系统评价了13个研究共811例患者,显示干细胞移植能够改善LVEF,减少左室收缩末容积及心肌损伤面积[34]。虽然干细胞移植还面临诸多问题,其横向分化的分子及细胞学机制还不清楚,植入后微环境影响机制及效果还不明确,现有的人体干细胞移植治疗没有统一的方法和标准,大部分临床试验的细胞源、细胞数及移植方法和时机都不相同,试验规模较小,但我们相信在不久的将来,干细胞移植方法将使冠心病的治疗手段发生重大改变。


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