养心汤含药血清对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞损伤模型差异基因表达的影响

关键词:养心汤;含药血清;内皮细胞;过氧化氢;基因芯片

摘要:目的通过观察养心汤含药血清对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞损伤模型差异基因表达的影响,探讨其内皮保护机制,为早期防治冠心病不稳定型心绞痛提供客观依据。方法采用H2O2体外诱导人脐静脉内皮细胞损伤的方法,建立人脐静脉内皮细胞损伤模型。实验分为①空白组;②模型组;③养心汤含药血清组,应用Affymetrix人基因组U133 +2.0芯片观察养心汤含药血清对H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞损伤模型的差异基因表达的影响。结果:模型组与空白组比较表达上调养心汤含药血清组与模型组比较表达下调的基因有23个,模型组与空白组比较表达下调,养心汤含药血清组与模型组比较表达上调的基因有12个,经MAS分析后,养心汤含药血清干预人脐静脉内皮细胞损伤模型差异基因的功能主要集中在与核酸结合、与蛋白激酶结合、蛋白质合成和转运、血小板活化、细胞黏附等方面。结论:1.养心汤含药血清可以减轻H2O2对人脐静脉内皮细胞增殖的抑制作用;2.养心汤含药血清干预人脐静脉内皮细胞损伤模型差异基因的功能主要集中在与核酸结合、与蛋白激酶结合、蛋白质合成和转运、血小板活化、细胞黏附、调控细胞增殖、细胞生长等方面,这可能是其保护内皮细胞损伤,防治冠心病不稳定型心绞痛的主要机制之一。

冠心病是严重威胁人类健康和生命的疾病之一,随着科学的进步和人类生活水平的提高,其发病率居高不下。冠心病不稳定型心绞痛(UA)是介于稳定型心绞痛和急性心肌梗死之间的急性冠脉综合征(ACS)的一种,具有进行性恶化的特点,易演变为急性心肌梗死或猝死,因此对UA发病机制及防治的研究具有重要的现实意义。养心汤出自明代王肯堂的《证治准绳》,具有益气养血、养心安神的作用。在多年的临床工作中,应用养心汤做为主方进行加减治疗冠心病不稳定型心绞痛患者,取得了较好的疗效,为进一步探讨其作用机制,故利用基因芯片技术对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞损伤模型差异基因进行了实验研究,现将结果报告如下。

实验材料

1.1 实验动物

雄性Wistar大鼠20只,2月龄,体重240g±20g,由黑龙江中医药大学动物中心提供,动物合格证号:SCXK(黑)2008001。在通风,温度、湿度适宜的动物室内常规饲养。

1.2 实验细胞

人脐静脉内皮细胞株,由北京清源浩生物公司提供。

1.3 实验药物

养心汤:由古方养心汤中药物加减组成,黄芪、茯神、半夏、当归等十三味中药购自于黑龙江省药材公司,由黑龙江中医药大学制剂室制备成浸膏,每克浸膏含生药量为6.2g。在浸膏内加入蒸馏水定期配置成混悬液,浓度为60%。

1.4 主要试剂

人脐静脉内皮细胞培养液:北京清源浩生物公司,胰蛋白酶:Amesico公司, 30%H2O2溶液:北京清源浩生物公司,胎牛血清:Gibco公司,TrizolRNAIsolation:Invitrogen公司,逆转录试剂盒:Invitrogen公司

1.5 主要仪器

Affymetrix人基因组U133 +2.0芯片:北京博奥生物公司,倒置荧光数字成像显微镜:Nikon公司,低温台式离心机:Eppendorf 公司,二氧化碳培养箱:Termo公司,紫外分光光度计ND-1000:NanoDrop公司,凝胶成像仪CBC/UVP1-D001:

CapitalBio公司。

实验方法

2.1 细胞复苏

快速取出冻存管放入37℃水浴锅中解冻,将细胞悬液移至已包含完全培养基的T-25培养瓶中,将培养瓶盖旋紧,轻轻的晃动培养瓶,让细胞分散均匀。将培养瓶放置在37℃培养箱中,24小时内不要动。

2.2 细胞培养及传代

在细胞达到60%融汇之前,保持隔天换液的频率;达到60%后每天换液;当细胞达到80%融汇的时候,弃培养液,以0.2%胰蛋白酶消化。镜下观察,见胞质回缩、细胞间隙增大后,终止消化,吹打瓶壁细胞,形成细胞悬液,加入培养液,吹打均匀,接种。4-5天传代一次,传3-5代备用。

2.3 养心汤含药血清制备

20只Wistar大鼠随机分为2组,分别为养心汤组和空白组。给药剂量按下面公式换算:给药剂量=临床常用量×动物等效面积系数×5,制备养心汤药液浓度为1.02g/ml,空白组给予等剂量生理盐水灌胃,Wistar大鼠每100g体重灌2ml药液或生理盐水。每日给药2次,早晚各一次,连续给药1周,于末次给药后1h心脏取血,采用一次性非抗凝真空采血管收集全血,无菌操作。采集的全血于4℃静置2h后,低温离心机离心,3500rpm/min,离心15min,分离血清,分离的血清同组混合,经56℃恒温灭活30min处理后,在超净台上用0.22µm微孔滤膜过滤除菌,-20℃保存备用。

2.4 模型制备及分组

实验分组分为3组:①空白组:在基础培养液中连续培养26h。②模型组:在基础培养液中连续培养24h后,加入100μmol·L- 1 H2O2作用2h。(H2O2的浓度及作用时间均为预实验结果)③养心汤含药血清组:在养心汤含药血清6%培养液中(养心汤含药血清浓度确定均为预实验结果)培养24h后加入100μmol·L-1

H2O2作用2h。

2.5 观测指标及方法

2.5.1 HUVEC形态学观察

2.5.2 养心汤含药血清对H2O2诱导HUVEC损伤模型差异基因表达的影响

统计学处理

应用SPSS13.0 for Windows统计软件进行统计分析。所有数据以均数±标准差(

±s)表示,多组间比较用F检验,两两比较用q检验。

4 结果

4.1 各组HUVEC细胞形态学观察

在倒置相差显微镜下,空白血清组的HUVEC细胞状态良好,细胞呈梭形或圆形,紧密贴壁,呈“铺路石”状生长,细胞折光性好,分裂相多。细胞呈扁平状,长梭形、多角形或椭圆形镶嵌状紧密排列,胞核居中明显微隆起,细胞边界清楚,无重叠生长现象。经H2O2氧化损伤后,细胞排列紊乱,由正常时的“铺路石”状变为长梭状或不规则状,胞核增大,部分细胞轮廓不清,细胞缩小变圆,可见局部细胞融合,坏死细胞崩解现象。坏死细胞较多,少数聚成团状或轮廓不清。养心汤含药血清组细胞形态有所改善,轮廓相对融合。

4.2 各组RNA电泳结果(见表1、图1)

表1 各组RNA电泳结果

分组

样品状态

A260

/280

A260

/230

浓度(µg/µL)

总量(µg)

电泳结果

养心汤含药血清组

TRIzol

1.99

0.80

0.192

15.4

RNA可用

模型组

TRIzol

1.93

0.49

0.187

14.9

RNA可用

空白组

TRIzol

1.89

0.86

0.176

14.1

RNA可用

 

图1各组RNA电泳图

图1示: 1:养心汤含药血清组;2:模型组;3:空白组

由表1和图1可见实验各组的RNA样品电泳条带清晰,28S比18S rRNA条带亮度大于1:1,质量符合基因表达谱芯片实验要求,RNA样品量足够用,可以进行基因表达谱的分析和实验。

4.3 养心汤含药血清对H2O2诱导HUVEC损伤模型的差异基因表达的影响

表2基因芯片的表达结果

分组

P(Present)

M(Marginal)

A(Absent)

养心汤含药血清组

25421(46.50%)

816

(1.49%)

28438(52.01%)

模型组

24931

(45.60%)

733

(1.34%)

29011(53.06%)

空白组

25534(46.70%)

729

(1.33%)

28412(51.97%)

由表2可见养心汤含药血清组基因表达者(P)25421个(占基因总数的46.50%),不表达者(A)28438个(占基因总数的52.01%),介于表达与不表达之间(M)者占816个(占基因总数的1.49%)。模型组基因表达(P)者为24931个(占基因总数的45.60%),不表达者(A)29011个(占基因总数的53.06%),介于表达与不表达之间(M)者占733个(占基因总数的1.34%)。空白组基因表达(P)者为25534个(占基因总数的46.70%),不表达者(A)28412个(占基因总数的51.97%),介于表达与不表达之间(M)者占729个(占基因总数的1.33%)。

经过基因芯片数据分析,结果模型组与空白组比较,差异表达基因为132个,其中上调基因为84个,下调基因为48个。养心汤含药血清组与空白组比较差异表达基因有1645个,其中上调基因为1371个,下调基因为274个。养心汤含药血清组与模型组比较差异表达基因为1248个,其中上调基因为1162个,下调基因为86个。模型组与空白组比较表达上调,养心汤含药血清组与模型组比较表达下调的基因有23个,分别是ALB、ATP7A、CCDC50、CD9、CPD、C10orf2、CST1、GSR、HS3ST3B1、KBTBD7、KLF3、NLRP14、NPHP1、NRP2、PHACTR3、POLR1B、PRKAB2、RAB2B、SHB、SMAD4、ST3GAL2、WNK1、ZRANB3;模型组与空白组比较表达下调,养心汤含药血清组与模型组比较表达上调的基因有12个,分别是FAM63B、JAM2、MPZL2、NF1、PEX3、PLK4、SNAPC3、TMEM67、TXNDC10、UFM1、VPS13C、ZNF652。

经过MAS分析和相关文献查询后,分子功能与ATP结合有关的基因是ATP7A、NLRP14、PLK4、WNK1、ZRANB3;与蛋白质结合有关的基因有PRKAB2、ALB、CCDC50、CD9、KBTBD7、MPZL2、NLRP14、NF1、NPHP1、PLK4、POLR1B、SHB、SNAPC3、UFM1、WNK1、ZNF652;与肌动蛋白结合有关的基因有DST、PHACTR3;与蛋白激酶结合有关的基因有PRKAB2;与蛋白酪氨酸激酶活性有关的基因有PLK4;与血小板活化有关的基因有CD9;与细胞黏附有关的基因有JAM2;与负调控细胞增殖、细胞生长有关的基因有SAMD4等。

讨论

   以益气养血、养心安神立法的养心汤加减治疗不稳定型心绞痛,在多年临床应用中,取得了令人满意的疗效,发现其不仅可以减轻患者的疼痛程度,也可减少其发病频率,减少硝酸甘油的用量,同时还降低发生心律失常的机率,提高了患者的生活质量。

基因芯片技术融合了生命科学、化学、微电子学、计算机科学、统计学和生物信息学等诸多学科领域的成就,具有高通量、简便、微缩、集约化、平行化等优点。中医学的精髓为整体观念和辨证论治理论,且中药具有作用多靶点等优势,这些优势同时也阻碍中医药科研的发展,但是随着基因芯片技术的日益成熟,可以在同一实验条件下,一次性检验上万个生物信息的改变,为中医药客观化、定量化、标准化研究提供了便利。本实验应用Affymetrix人基因组U133+2.0芯片研究养心汤含药血清对H2O2诱导的HUVEC损伤模型的差异基因表达的影响,结果显示养心汤含药血清干预HUVEC损伤模型后,有12个基因表达明显上调,23个基因表达明显下调。

经MAS分析和文献查阅,分子功能与ATP结合有关的基因是ATP7A、NLRP14、PLK4、WNK1、ZRANB3;与蛋白质结合有关的基因有PRKAB2、ALB、CCDC50、CD9、KBTBD7、MPZL2、NLRP14、NF1、NPHP1、PLK4、POLR1B、SHB、SNAPC3、UFM1、WNK1、ZNF652;与肌动蛋白结合有关的基因有DST、PHACTR3;与蛋白激酶结合有关的基因有PRKAB2;与蛋白酪氨酸激酶活性有关的基因有PLK4。这些蛋白是细胞生存所依赖的,这些基因参与细胞合成、代谢、细胞信息传递、细胞内外物质交换及生命物质的合成[1-3]

分子功能与血小板活化有关的基因有CD9,CD9是分子量为24KD的糖蛋白,属于新确定的跨膜4超家族(TM4SF)成员,广泛分布于血小板、前B细胞、单核细胞等造血细胞及一些非造血组织细胞[4],CD9可与活化的血小板中GPⅡb/Ⅲa相连接,从而对血小板的凝聚功能起调控作用[5],本实验中模型组CD9表达较空白组上调,表明H2O2对内皮细胞造成损伤后,引起血小板聚集到受损的内皮细胞上,从而促进PDGF的释放,导致肌内膜细胞不断增生,最终导致胶原合成,形成AS斑块。养心汤含药血清干预后,CD9表达较模型组下调,表明养心汤含药血清具有抑制血小板聚集,能够有效的防治UA。

分子功能与细胞黏附有关的基因有JAM2,JAM为连接黏附分子,是属于免疫球蛋白超家族(IgSF)的一类整合膜蛋白,包括JAM-1、JAM-2和JAM-3[6]。JAM分布于上皮细胞和内皮细胞的紧密连接处以及血小板、白细胞和红细胞的膜表面及淋巴管内皮细胞[7],参与内皮细胞之间连接复合物的构成,介导细胞之间的黏附,在细胞间连接黏附起重要的作用。本实验中模型组JAM2表达较空白组下调,表明H2O2作用于HUVEC,使紧密连接结构破坏,内皮细胞通透性增高,其屏障作用受损。养心汤含药血清组JAM2表达较模型组上调,表明养心汤含药血清能够降低内皮细胞通透性,维持机体内环境的稳定而发挥对内皮细胞屏障作用的保护作用。

分子功能生物进程与负调控细胞增殖、细胞生长有关的基因有SAMD4,Smad4[8]蛋白作为序列保守的smads蛋白家族的一员,其是TGF-β信号转导通路的中心分子,主要功能是参与转化生长因子β(TGF-β)超家族细胞内信号转导。所有生物学效应均是Smad4与不同的SmadS蛋白相互作用的结果。本实验中模型组Smad4表达较空白组上调,表明过氧化氢氧化损伤脐静脉内皮细胞,而养心汤发挥益气养血、养心安神的调整阴阳平衡的作用,可以下调smad4mRNA的表达,通过TGF-β/Smad信号通路和对VEGF基因的调控作用,使细胞内外的离子达到平衡状态,调节和促进细胞的修复,抑制自由基的产生,减轻过氧化损伤对血管内皮细胞的增殖活性抑制。

参考文献

1.PengW,JinL,Hendersonq,et al.Mapping herpes simplex virus type l latency associated transcript sequences that protect from apoptosis mediated by a plasmid experssing caspase-8[J].J Neurovirol

2004,10(4):260-5.

2.Chuderland D and Seger R.Protein-protein interactions in the regulation of the extracellular singal-regulated kinase[J].Mol Biotechnol,2005,29(1):57-74.

3.Hindley A and Kolch W.Exrtacellular singal regulated kinase(ERK)/ mitogen activated protein kinase(MAPK)-independent functions of Raf kinases[J].J Cell Sci,2002,115(8):1575-81.

4.李凤焕,沈德诚,陈桂彬,等. CD9抗原在白血病细胞上的表达及意义[J].中华血液学杂志,1998,19(3):155-156.

5.彭林,李家增.CD9抗原与血小板活化[J].血栓与止血学杂志,1995,2(4):175-177.

6.Bazzoni G,Martinez Estrada OM,Mueller F,et al.Homophilic interacttion of junctional adhesion molecule[J].Biol Chem,2000,275:30970-30976.

7.Thomas FC,Sheth B,Eckert JJ,et al.Contribution of JAM-1 to epithelial differentiation and tight-junction biogenesis in the mouse preimplantation embryo[J]. Cell Science,2004,117:5599-

5608.

8. Attsano Letal.Mads and Smads in.TGF-βsignalling.Cur opin Cell Biol,2000:12(2):235


    2010/11/27 19:14:17     访问数:941
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2010/12/4 16:29:11
吴奇志:很好的
2010/11/28 17:49:57
刘进民:拜读了
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