促红细胞生成素对人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的影响

作者:师天雄[1] 解孝章[1] 
单位:广东省中山市人民医院[1]

[关键词]促红细胞生成素;骨髓间充质干细胞;血管内皮细胞;分化  经典2010

[摘要]目的 探讨促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向血管内皮细胞诱导分化的影响。方法 从正常人骨髓中分离获取MSCs,体外培养扩增、纯化后,分4组对其进行诱导分化:①EPO组;②碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)+血管内皮细胞生长因子(VEGF)组;③EPO+bFGF+VEGF组;④DMEM培养液对照组。诱导前后行流式细胞仪检测表面标记CD29、 CD31、 CD34、 CD44,免疫细胞化学鉴定vWF抗体。结果 EPO组、bFGF+VEGF组及EPO+bFGF+VEGF组诱导MSCs后的细胞CD31、CD34表达率升高,CD29、 CD44表达率降低,vWF抗体阳性。结论 促红细胞生成素可以诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化,但联合碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子并不能进一步促进骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞转化。

Influence of erythropoietin on the induction and differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into endothelial cells

SHI Tian-xiong, ZHANG Ming-guang ,JI Ming-fang,CHENG Wei-min,LI Xiao-ling,

HE Jie-bing,MIAO Jian-hang, HU Xi -xiang,XIE Xiao-zhang

(Zhongshan people’s hospital, Zhongshan 528400,China)

 [Abstract]  Aim: To investigate the influence of erythropoietin on the induction and differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into endothelial cells.Methods: The hMSCs were isolated from bone marrow of human.After purified in vitro,the hMSCs were induced to differentiation in four groups:①erythropoietin(EPO)group;②basic fibroblast growth factor(bFGF)+vascular epidermal growth factor(VEGF)group;③EPO+bFGF+VEGF group; ④DMEM group. Inducted cells were characterized by flow-cytometry CD29、 CD31、 CD34、 CD44 and immunocytochemistry vWF.Results: The hMSCs were induced by EPO group 、bFGF+ VEGF group and EPO+bFGF+VEGF group. The expressions of  flow-cytometry CD31、 CD34 were increased and CD29、 CD44 were decreased. Immunocytochemistry analysis showed typical expression of the von Willebrand factor.Conclusion: The hMSCs can be cultured and differentiated into endothelial cells by EPO in vitro. EPO+bFGF+VEGF group can not promote the hMSCs induce into endothelial cells.

[Key words] Erythropoietin; Mesenchymal stem cells; Endothelial cells; Differentiation

骨髓中的间充质干细胞具有高度增殖和自我更新能力,并在不同的诱导条件下,具有向3个胚层组织细胞分化的能力,可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱和韧带、血管内皮细胞、神经元细胞、神经胶质细胞、肝细胞、皮肤干细胞、表皮细胞等。利用MSCs多向分化及其在体外表达多种外源基因的特性,将其作为种子细胞用于组织工程学已成为当前研究的热点。目前国内外学者通过血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子刺激人骨髓间充质干细胞可分化为血管内皮细胞[1,2],但对EPO对人MSCs向血管内皮细胞诱导分化的影响的研究未见报道。本实验从体外分离、纯化、培养和扩增人MSCs,并检测MSCs的免疫学表型,探讨EPO对其体外诱导分化作用,为进一步研究MSCs的定向诱导分化和应用提供基础。

材料和方法

1.1  材料

1.1.1  标本来源:

健康志愿者骨髓10ml,志愿者知情并同意。

1.1.2 实验器材与试剂

Percoll分离液(Pharmacia公司),特级胎牛血清(Hyclone公司),低糖DMEM培养液(Hyclone公司),血管内皮细胞生长因子(VEGF,Peprotech公司)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,Peprotech公司)、促红细胞生成素(EPO,Biovision公司),0.25%胰蛋白酶(上海生物工程公司),异硫氢酸荧光素标记的CD29(CD29-FITC) 、CD44-FITC(Beckman coulter公司);藻红素标记的CD31(CD31-PE,BD公司)、CD44-PE(Beckman coulter公司),兔抗vWF多克隆抗体、荧光标记的山羊抗兔IgG(中美科技有限公司),离心机,培养箱,培养瓶,倒置相差显微镜(Olympus公司),荧光显微镜(Olympus公司)。

1.2  方法

1.2.1 人骨髓间充质干细胞的分离培养

无菌条件,利多卡因局麻下抽取健康志愿者髂后上棘骨髓10ml,放入有肝素的试管中。移入离心管,沿管壁加入等量的密度为1.073 g/ml Percoll分离液,2500g,15 min离心,用吸管吸取中间单个核细胞层,用生理盐水重悬, 800 g,8 min离心洗涤,细胞计数,结果为4.0×106。加入完全培养液(低糖DMEM+10%胎牛血清),调成4.0×105/cm2的密度接种于50ml的培养瓶中,置于37℃,5%CO2饱和湿度的培养箱内培养。培养72 h后,全量更换培养液,弃掉未贴壁细胞,以后每2~3天换液1次,到第9天贴壁细胞长到90%融合时用0.25%的胰酶消化传代,以1:3传代扩增培养。倒置相差显微镜拍摄细胞培养照片。

1.2.2  MSCs的鉴定

MSCs体外增殖培养到第3代共得到9瓶培养细胞,随机取出其中的1瓶细胞消化,流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、 CD31、 CD34、 CD44。检测结果数据如表1,图见图1。CD29、CD44表达率高,CD31、 CD34表达率低,确定是MSCs。

1.2.3  MSCs的诱导分化

从第3代MSCs剩余8瓶培养细胞中随机取出5瓶,既5组,每瓶消化后分为4瓶(密度为2.7×105/cm2),4瓶分别加入EPO; VEGF+bFGF ; EPO+VEGF+bFGF;DMEM继续培养。加入浓度为EPO 5u/ml,VEGF 10ng/ml,bFGF 50ng/ml。DMEM培养液为对照组。

1.2.4  流式细胞仪检测

以上5组共20瓶细胞培养2周贴壁细胞长到90%融合时用0.25%的胰酶消化,弃上清,留细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、 CD31、 CD34、 CD44。

1.2.5 免疫组织化学染色

取第3代MSCs其中1瓶消化传代分为4瓶,分别加入EPO; VEGF+bFGF ; EPO+VEGF+bFGF;DMEM。浓度为EPO 5u/ml,VEGF 10ng/ml,bFGF 50ng/ml。培养2周贴壁细胞长到90%融合时倒去培养瓶中的培养液,PBS冲洗3次,每次5min;多聚甲醛室温固定15min;PBS洗涤3次,每次5min;3%过氧化氢37℃培养箱孵育10min;蒸馏水冲洗3次,PBS浸泡5min;加入山羊血清,37℃培养箱孵育15min;倾倒血清,加兔抗vWF多克隆抗体(1:200)37℃培养箱孵育30min;放4℃冰箱过夜。放置37℃培养箱孵育30min;PBS冲洗1次;加荧光标记的山羊抗兔IgG(1:200)37℃培养箱孵育120min。孵育后倾去兔抗山羊IgG,PBS冲洗3次,每次5min。倒置荧光显微镜下观看拍照。

1.2.6统计学处理

数据用均数±标准差表示,采用SPSS软件(V 11.0)进行随机区组设计资料的方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

结  果

3.1  骨髓间充质干细胞的细胞形态学观察

分离细胞于第2d开始逐渐贴壁,数量少,呈细小长梭形,散在分布,第4d贴壁细胞覆盖瓶底约50%,第9d观察见较多细胞克隆,生长密集,呈较大长梭形纤维样细胞,覆盖瓶底约90%。第1~3代MSC生长迅速,5~7d就长满瓶底,细胞逐渐变的宽大,有的分叉,如图2. MSCs经细胞因子诱导培养2周后,倒置相差显微镜观察各组细胞形态与对照组无显著差别,第1、3组细胞于第9、8d开始融合,第2、4组细胞于第6、7d开始融合,如图3。

3.2  促红细胞生成素对人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化的影响

流式细胞仪检测4组细胞表面标记CD29、 CD31、 CD34、 CD44,统计学方差分析结果示EPO组,VEGF+bFGF组, EPO+VEGF+bFGF组与DMEM对照组检测CD29、 CD31、 CD34、 CD44比较,P<0.05,差异有统计学意义,即说明EPO,VEGF+bFGF, EPO+VEGF+bFGF都可以诱导人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化,但3组之间差异无统计学意义,说明EPO联合VEGF+bFGF并不能使转化率提高。统计结果见表2。

3.3  免疫细胞化学

DMEM 组血管内皮细胞特有表面标记vWF荧光染色表达弱。而EPO组;VEGF+bFGF组; EPO+VEGF+bFGF组vWF荧光染色表达都明显较强。图4所示

讨  论

促红细胞生成素(EPO)主要由人肾脏皮质与髓质交界处的肾小管旁细胞分泌,主要作用为通过表达于红系祖细胞表面的EPO受体(erythropoietin receptor,EPOR) 促进红系祖细胞的增殖与分化为成熟红细胞,临床上已广泛用于治疗肾衰竭、化疗及外科手术等多种原因所造成的贫血。EPOR受体也广泛表达于人体内的非造血组织,包括肝脏、大脑、子宫、血管内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞等。它们与EPO结合激活某些信号途径,发挥抑制细胞凋亡、促进血管生成等多种与促进造血无关的组织和细胞保护作用,因此,EPO可能在心血管系统中有着造血以外的多种生物学作用。

EPO可以促进人骨髓间充质干细胞的增殖[3,4]。现也已明确EPO可促进内皮祖细胞迁延、分化,引导血管内皮细胞归巢,形成血管[5]。本实验证明EPO单独或联合VEGF+bFGF可以促进人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化, 从而为进一步研究MSCs诱导分化及其在血管组织工程学等方面的应用提供理论基础。但其机理还不明确。hMSCs增殖分化过程中分泌VEGF[6], VEGF促进hMSCs向血管内皮细胞分化,促进血管新生[7],而EPO有促进hMSCs分泌VEGF的作用[3],因此需要进一步明确的是:EPO直接促进人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化还是间接促进hMSCs分泌VEGF增加,VEGF促进向血管内皮细胞分化。

我们实验中EPO+VEGF+bFGF组虽然较EPO组、VEGF+bFGF组促进人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化CD值变化明显,但统计学无明显差异,无统计学意义,得出EPO联合VEGF+bFGF并不能使转化率提高的结论。考虑是不是分组数较少影响对比结果,需进一步增加组数实验证实。

参考文献

[1] 梁峰,王韫芳,南雪,等. 体外诱导人骨髓间充质干细胞定向血管内皮细胞分化[J]. 中国医学科学院学报, 2005,27(6):665-669.

[2] Minguell JJ, Conget P, Erices A. Biology and clinicai utilization of mesenchymal progenitor cells[J]. Braz Med Biol Res, 2000, 33: 881-887.

[3] 林海泓,肖萍,朱军,等。重组人促红细胞生成素对骨髓间充质干细胞增殖及分泌功能的影响[J]. 复旦学报(医学版), 2007,34(5):674-677.

[4] 张海红,侯相麟,王小蕊,等。促红细胞生成素对人骨髓间充质干细胞增殖和细胞周期的影响[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2008,12(29):5671-5674。

[5] Matsumoto R,Omura T,Yoshiyama M,et al.Vascular endothelial growth factor expressing mesenchymal stem transplantation for the treatment of acute myocardial infarc[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2005,25(6):1168.

[6] Barry FP,Boynton RE,Haynesworth S,et al,The monoclonal antibody SH -2,raised anginsthum an mesenchym alstem cells,recognizes an epitopton endoglin[J].Biochem Biophys Res Commun.1999,265:134-139.

[7] Noseda M ,McLean G,Niessen K ,et al.Notch activation results in phenotypic and functional changes consistent with endothelial to mesenchymal transformation[J].Circulation Research.2004,94(7):910-917.

表1:流式细胞仪检测第3代MSCs表面标记CD值

CD抗体

CD29

CD31

CD34

CD44

CD值(%)

65.0

1.0

2.5

63.9

图1:流式细胞仪检测第3代MSCs表面标记CD图

 

 

图2:MSCs体外培养照片

  (倒置相差显微镜,×100。A:原代细胞培养第4d;B:原代细胞培养第7d;C:第1代细胞培养第3d;D:第1代细胞培养第7d。图中箭头所指均是贴壁的MSCs。)

图3:MSCs体外诱导后培养14d照片

(倒置相差显微镜 ×100。a: DMEM组;b: EPO组;c: VEGF+bFGF组;d: EPO+VEGF+bFGF组。图中箭头所指均是贴壁细胞。)

表2:统计软件处理数据:

DMEM

EPO    VEGF+FGF   EPO +VEGF+FGF

P值

CD29值

66.04±5.86

40.88±12.14

43.20±9.74

48.36±7.25

P=0.002

CD31值

1.36±0.50

3.15±0.67

4.11±2.11

3.55±0.89

P=0.016

CD34值

2.68±0.62

5.89±1.01

6.41±1.04

6.29±1.94

P=0.001

CD44值

72.18±4.77

48.82±11.69

51.66±10.92

56.20±11.83

P=0.008

图4:体外诱导后MSCs免疫细胞化学vWF荧光染色照片

 

(倒置荧光显微镜,×100a: DMEM组;b: EPO组;c: VEGF+bFGF组;d: EPO+VEGF+bFGF组。图中箭头所示细胞均是vWF荧光染色阳性细胞。


    2010/9/19 9:25:57     访问数:1541
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吴奇志:拜读了
2010/9/19 20:02:13
刘进民:拜读领教
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