凝血酶激活的纤溶抑制物: 新的凝血纤溶调控因子

   凝血酶激活的纤溶抑制物(Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor,简称TAFI),是近十年来国外医学界研究凝血及纤溶调控因子的热点之一。TAFI的基础研究,是对经典的凝血及纤溶调控机制进行的重要补充。通过此项研究,可以解释临床各科血栓相关性疾病的发生﹑发展等过程。现将近年来的研究及进展作一介绍。   TAFI基础研究[1]   结构、理化性质简介1.1  命名     在TAFI研究史上,曾经使用过多种名称,名字的变迁,反映人们的了解不断深入。TAFI最早是从血清中发现,具有羧肽酶样活性,又因对热不稳定,对精氨酸的特异性比对赖氨酸强,故Hendriks曾称之为CPU (carboxypeptidase unstable);Campbell和Okada命名为CPR(carboxypeptidase Arginine);后来Eaton从血浆中也分离出,称之为pro-PCPB(plasma carboxypeptidase B)。近年来,人们发现其主要与凝血及纤溶有关,遂根据其主要激活物凝血酶命名为TAFI。1.2  化学结构特点   TAFI存在于正常人体中,是单链血浆蛋白,分子量约为60 k-Da。其在血循中以无活性的酶原形式存在。TAFI基因定位于13q14,其DNA外显子有48Kb,5端区域不含TATA序列,但有一个约70Kb的序列使其能在肝内特异性转录。TAFI上有赖氨酸及谷氨酸的受体位点(于2﹑5﹑292位谷氨酸)。TAFI主要由肝脏细胞合成,其前体经蛋白酶作用释放出信号肽及TAFI。而TAFI在凝血酶﹑纤溶酶﹑肝素﹑胰蛋白酶等作用下释放出活性肽及活性TAFI(TAFIa )。TAFIa 构型可自发地可逆地改变,形成灭活形式(TAFIa i)。凝血酶或纤溶酶于TAFIa i 上302位精氨酸进行剪切,产生两个片段,这样便能不可逆地阻止TAFIa i 恢复活性。TAFI经活化凝血酶作用,产生三个片段,分别为35- kDa﹑25- kDa﹑14- kDa产物。而其中只有35- kDa产物才与抑制纤溶及羧肽酶B样活性有关。TAFI与羧肽酶B在基因上具有共同祖先来源,两者氨基酸序列具有40%的相同性。两者皆可由胰蛋白酶激活;且TAFIa 具有类似羧肽酶B的外切酶活性:剪切蛋白质羧基端上的精氨酸或赖氨酸,从而改变蛋白质底物的活性。非激活状态的TAFI与羧肽酶B不同之处在于,前者受胰蛋白酶激活后状态不稳定(温度升高时可导致活性下降)。在体内,TAFIa主要于纤维蛋白羧基端上精氨酸或赖氨酸进行剪切,使纤溶酶失去与纤维蛋白作用的位点,从而抑制纤溶活性,导致溶栓时间延长,增加了血栓形成的危险性[1]。在Wang Wei﹑Michael 等的溶栓实验中发现:在缺乏TAFIa的情况下,血栓溶解时间约为33分钟;血液中未能检测到游离的精氨酸及赖氨酸。在TAFIa存在的情况下,溶栓时间延长到92分钟 而血栓形成后,血精氨酸浓度立即升到9.8mmol/l , 随后赖氨酸也升至6nmol/l。在一定条件下,TAFIa浓度与溶栓时间呈正相关。TAFIa 浓度只有TAFI的1/10时可最大限度地延长溶栓时间。当t-PA的纤溶诱导能力达到最大值一半时,用TAFIa使其减弱所需的浓度约为1nmol/l。此外,TAFIa具有对热的不稳定性。Michael 的实验证实,当TAFIa上的精氨酸(302或330位)突变为谷氨酸时,该特性仍然表现明显。突变前,精氨酸残基与邻近残基形成离子键及氢键,使TAFIa稳定于原来的结构;突变后,谷氨酸能使TAFIa对热的稳定性减弱,从而结构容易受温度影响而发生改变。TAFIa空间构架改变导致抗纤溶活性下降,荧光活性减弱;结构的改变也为凝血酶,纤溶酶创造了剪切位点,所以TAFIa还容易被纤溶酶﹑凝血酶剪切。在可以使TAFIa酶活性完全灭活的温度中培育TAFIa,凝血酶﹑纤溶酶剪切TAFIa的过程加速。但反过来,凝血酶对TAFIa的剪切程度却不影响TAFIa活性衰减的速率。凝血酶﹑纤溶酶对TAFIa的蛋白剪切作用在很大程度上依赖于TAFIa热不稳定性[2]。在TAFIa活性下降并被灭活的过程中,温度升高的因素比蛋白剪切分解的因素更为重要。TAFIa330位的精氨酸突变为谷氨酸不能防止凝血酶的剪切,而302位的精氨酸突变为谷氨酸则可减弱甚至于破坏凝血酶的剪切。在体外37ºC时,TAFIa半衰期为10~15分钟,25 ºC时为 74 分钟[3]。但若有TAFI竞争性拮抗剂存在时,却可使TAFIa半衰期延长,即可以在37ºC稳定60分钟以上。TAFIa半衰期的长短,将直接影响其抗纤溶作用的发挥。实验结果还表明[4],TAFIa参与体内灭活缓激肽,进而调节血管张力。血浆缓激肽水平与TAFIa活性有关,后者活性下降时,缓激肽活性增强。从理论上推测,其原因可能在于:羧肽酶B与血管紧张素转换酶(ACE)结构相似,其活性中心皆含锌离子,同属锌蛋白酶(外肽酶),两者皆可从底物羧基端将氨基酸残基一个个水解下来[5]。ACE作用于缓激肽的羧基端,脱去苯丙氨酰精氨酸,使之失去活性。而TAFIa功能类似于羧肽酶B,又与其结构基因具有同源性,故TAFI也可如ACE一样灭活缓激肽。但真正是否如此,尚待实验证实 。除此之外,TAFI与ACE在其它性质上是否还具有相似之处,仍待研究。    激活   TAFI以无活性的酶原形式在血液中循环,其血浆平均浓度约为75nmol/l 。测量方法不同,结果可有38%~169%的波动,也有实验报道称TAFI的血浆浓度为(113±13)nmol/l。当其浓度﹥275nmol/l时,与血栓溶解时间呈正相关。TAFI在体内可被凝血酶﹑凝血酶调节蛋白(TM)﹑纤溶酶﹑肝素﹑胰蛋白酶等物质激活。2.1 凝血酶﹑凝血酶调节蛋白与TAFI   单纯凝血酶作为激活物时作用较弱。其激活效率与浓度有关,高浓度可提高激活效率。当凝血酶接近500nmol/l时,可在10分钟内激活TAFI。但只有在凝血酶-凝血酶调节蛋白(TM)复合体存在时,激活效率才高,约为凝血酶单独激活的1250倍。当凝血酶为0.4ku/l,TM为16nmol/l时可最大激活TAFI,激活时间小于15分钟。该激活过程需要钙离子,钙离子对TAFI的有效激活至关重要。在Dmitry等的实验中,凝血酶-凝血酶调节蛋白可以使TAFI活性由原来的100U/L(约106nmol/l)上升至430U/L(约455nmol/l)。当以上复合体及钙离子同时存在时,几乎可将血浆中的TAFI全部激活。在激活过程中,凝血酶先与底物(TAFI)和TM先后结合成三者的复合物,然后水解TAFI上92位的精氨酸,产生活性形式的TAFIa;若水解302位精氨酸,则使TAFI活性下降。在温度升高的情况下,以上反应加速。凝血酶调节蛋白是细胞膜上的跨膜蛋白, 在人体小血管及毛细血管中含量很高,当与凝血酶结合成复合物时,转化及调节凝血酶的作用。凝血酶-凝血酶调节蛋白复合物不影响纤溶酶激活TAFI的过程[3]2.2 纤溶酶﹑肝素与TAFI   纤溶酶单独激活TAFI的能力是凝血酶的8倍。Western印迹分析法证实,该过程可被普通肝素加强,同时,该过程不需要钙离子。在普通肝素存在时,纤溶酶激活TAFI的能力增强至16倍。普通肝素增强纤溶酶的激活过程是剂量依赖性的,并具有饱和性。普通肝素或其它氨基葡聚糖在一定浓度下也可单独激活TAFI,但普通肝素单独激活效率仅为凝血酶的1/10。另外,普通肝素可使TAFIa活性稳定,防止其自发灭活[3]。 如普通肝素存在时,可使TAFIa25 ºC时的半衰期延长至170分钟。在体内,普通肝素发挥抗凝活性的最小治疗浓度约为(0.2~0.5)u/ml之间,而其激活TAFI的浓度约为5u/ml。普通肝素不影响凝血酶及凝血酶-凝血酶调节蛋白复合物激活TAFI的过程。   低分子肝素的研究结果与普通肝素类似[3]。硫酸软骨素B(Chondroitin sulfate B)(即硫酸皮肤素dermatan sulfate)比硫酸软骨素 A和 C 激活能力更强。而右旋糖酐(Dextran sulfate) 5000 和8000表现的活性比普通肝素更强。硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate) 和硫酸角质素(keratan sulfate)在浓度为0.5mg/ml时不激活TAFI,但在高浓度时参与激活由纤溶酶介导的TAFI激活。    纤溶酶降解纤维蛋白,使纤维蛋白暴露羧基端的赖氨酸残基。该残基既可作为纤溶酶在纤维蛋白上新的结合位点,又可作为辅因子,促进纤溶酶形成。这种降解的纤维蛋白比纤维蛋白本身更能增强t-PA介导的纤溶酶原激活过程。而TAFIa 可以在纤维蛋白羧基端精氨酸或赖氨酸位剪切,间接阻止纤溶酶原激活成纤溶酶,进而抑制纤维蛋白的降解,导致溶栓时间延长。实验证明,当血浆TAFIa达到最大活性时,可在1至3分钟内消除纤溶酶结合到纤维蛋白上的位点。在血块溶解之前,TAFIa只影响纤溶酶原激活的爆发阶段( burst phase),而不完全抑制纤溶酶形成。它也只能在一定程度上延长溶栓时间,而并不能完全防止血栓溶解。并且只有在谷氨酸型纤溶酶原存在(非赖氨酸型存在)时,TAFI才可以抑制由t-PA诱导的纤溶过程。    TAFI在高浓度时, 还可以直接灭活纤溶酶。 纤溶酶激活TAFI后,蛋白自行分解,释放出羧基末端的精氨酸残基。分解后的纤溶酶不再具有激活TAFI的作用。所以,纤溶酶激活TAFI的过程是一个负反馈的过程[3]2.3 胰蛋白酶与TAFI   胰蛋白酶于TAFI 92位精氨酸剪切形成活性TAFI(TAFIa),于330位精氨酸剪切则可灭活TAFI。用羧肽酶的竞争性抑制剂6-氨基己酸(εACA)可以选择性限制胰蛋白酶剪切TAFIa。6-氨基己酸可限制胰蛋白酶剪切330位精氨酸,而并不影响其剪切92位精氨酸。   活性调节   目前尚未能发现与TAFI活性及血液浓度调节有关的特异性生理和病理因子。一般认为影响因素有:   ①温度调节:温度越高,TAFI活性越不稳定,这与构型改变有关。此为目前发现影响活性最主要的因素。   ②血液因子调节:纤溶酶﹑凝血酶于TAFI302﹑330位上精氨酸行蛋白水解,使活性下降。胰蛋白酶于330位精氨酸剪切则可灭活TAFI。活化的蛋白C通过灭活活化的因子Ⅴ﹑因子Ⅷ,从而减少凝血酶的形成,使TAFI活化的过程受抑。   ③竞争性抑制剂:如2-胍基巯乙基琥珀酸(GEMSA)使TAFI抗纤溶作用完全被抑制。   ④在血浆中与α2-巨球蛋白结合的TAFI可避免活性抑制。   ⑤TAFI只有在内源性凝血途径完善时才能影响血栓溶解时间,假如存在因子Ⅺ抗体,则会抑制TAFI抗纤溶作用[6]。   ⑥普通肝素可使TAFIa活性稳定。    TAFI与临床      Juhan-Vague在对626个患者运用ELISA法测定体内TAFI抗原水平后认为:在女性中,TAFI与年龄相关。随着年龄增长,TAFI有上升趋势。在男性中未发现这种趋势。男性的TAFI与血压值﹑腰围/臀围之比呈正相关[7]。而在Katinka 等利用HPLC辅助检测CPU前体(TAFI)活性的实验中,发现男性40~49岁组TAFI活性增高并与年龄正相关,在女性50~60岁年龄组也有同样关系[8]。   1  TAFI与凝血、血栓相关性疾病1.1  Juhan-Vague指出,当体内TAFI血浆浓度>129nmol/l时,可使血栓危险性增加一倍[1]。在狗的冠状动脉血栓模型中,Redlitz发现随着血栓的形成,TAFIa活性上升。Tilburg等在Leiden易栓症研究中也指出升高的TAFI水平是导致深静脉血栓的轻度危险因子。近来,法国的一项研究也表明, TAFI基因型为Ala147Thr多态性的个体, 若该类基因表达频率高,则其TAFI基础值显著高于正常对照者,其后更容易发展为变异型心绞痛[18]。但在欧洲,对TAFI与人群心肌梗塞发病关系的研究,南部与北部调查的结果是矛盾的。目前尚无有力证据表明TAFI水平升高与心梗发病相关[15]1.2  在接受肾移植的患者中,心血管病是其主要的死亡原因之一。Hryszko等经临床试验发现,TAFI在此扮演着相当重要的角色[12]。肾移植后,服用免疫抑制剂如环孢菌素A造成内皮细胞损伤,使TM水平升高。同时,患者原有的高胆固醇血症也使凝血酶活性增强。以上两者可使血浆TAFI活性增高,患者纤溶受抑,动脉粥样硬化程度加重,心血管事件发生率及死亡率上升。1.3  在人体小血管及毛细血管中,与内膜相关的TM浓度很高(有的局部浓度高达40mg/ml),故TM激活TAFI的机制对该处血管很重要。实验表明:TM浓度低至12ng/ml时已使溶栓明显延迟。而血浆可溶性TM浓度在正常人为(30~50) ng/ml,在系统性红斑狼疮患者为70ng/ml,在糖尿病微血管病变患者高达(200~400)ng/ml。所以在系统性红斑狼疮及糖尿病微血管病患者中,溶栓时间可以延长。这也许为这些患者的凝血功能障碍提供了新的理论依据。Broze在研究血友病患者时提出其出血原因之一并非由于凝血酶缺陷导致血栓不能形成, 而是因为没有足够的凝血酶激活TAFI,导致血栓不稳定,易受纤溶酶分解。 Lisman等在研究肝硬化患者纤溶状态的试验中发现[11],其体内TAFI抗原水平下降,并与抗凝血酶及α2-抗纤溶酶活性水平高度相关,但由于这些患者纤溶酶原等纤溶因子水平也下降,肝硬化患者并不一定出现纤溶亢进。其溶栓时间与正常对照组相仿。1.4  TAFI与其它疾病    在间质性肺病患者的肺泡灌洗液中, TAFI与蛋白C抑制物的水平显著高于正常个体。学者们通过逆转录PCR的方法揭示了这些患者的肺泡巨噬细胞与上皮细胞可表达TAFI抗原。以上结果提示活化的TAFI参与了间质性肺病肺泡内纤溶能力降低的发病过程[13]。 糖尿病患者的血TAFI水平显著高于正常人,肥胖的糖尿病患者的TAFI水平又显著高于不肥胖的糖尿病患者和健康者。TAFI的血浆水平与糖基化血红蛋白﹑肥胖及胰岛素抵抗显著相关[16]。此外,对于有先兆子痫和(或)胎儿宫内发育迟缓的孕妇,因其肝脏合成TAFI能力下降,同时肾脏排泄TAFI增加,导致血浆TAFI水平下降,使得这些孕妇的血栓发生率相对下降[14]。对于肾病综合征的患者, 其血管内皮受损,激活了凝血系统, 从而血浆TAFI活性及水平也增高, 其TAFI活性与血清肌酐呈明显正相关, 但与蛋白尿、白蛋白、胆固醇、甘油三酯水平等无直接关联[17]。   此外,在风湿性关节炎的患者中, TAFIa可能参与局部的炎症反应,降解C3a﹑C5a。   2  TAFI与药物2.1 口服避孕药﹑降血脂药    Juhan-Vague认为,使用口服避孕药﹑降压药与降血脂药不影响TAFI浓度。对于体内TAFI抗原水平,他认为主要受遗传因素控制,而与环境因素关系不大[13]。但是 Malyszko等在对床边腹透 (CAPD)患者的高脂血症进行西伐他汀治疗6个月后,发现该药可使TAFI水平显著下降[9]。Tilburg等在由474名深静脉血栓患者及474名健康者组成的病例对照研究中发现,口服避孕药可以升高TAFI的水平[1];对于避孕药与TAFI的关系。目前较多的研究者倾向后一种观点。2.2 肝素   人们在研究普通肝素与TAFI的关系中发现,一定浓度的普通肝素或其它氨基葡聚糖能激活TAFI, 延长溶栓时间,不利于溶栓及血管再通。这能否为临床上肝素促使部分患者发生肺栓塞提供理论依据尚不得知。而从另一角度来看,这个过程能使血栓稳定于原位,不易脱落,可能会减少肺栓塞的栓子来源。同理,当血管壁受到损伤时,暴露出细胞外基质的粘多糖(氨基葡聚糖),其也通过增强TAFIa活性,抑制纤溶、稳定血栓来保护损伤血管壁的完整性。 这个作用可以被TAFI拮抗剂或富含组氨酸的糖蛋白拮抗,后者可以与普通肝素结合,作用强弱受剂量影响。从以上特点,表现出血栓症中肝素治疗的双面性[3]:抗凝与抑制纤溶。   此外,只要肝素浓度大于0.5U/ml,即可完全抑制血液中游离的凝血酶,但对于血栓表面的凝血酶,肝素浓度即使大于1U/ml,也不能对其产生抑制。而血栓表面的凝血酶尚可诱发局部TAFI活化而拮抗纤溶。2.3  TAFIa抑制剂   在心肌梗塞的患者中,由于溶栓剂﹑抗凝剂﹑抗血小板药物的联合使用,出血率增高。而Klement等提出一个能增强溶栓疗效又相对安全的新方法[10],即联合运用TAFIa的抑制剂。TAFIa的抑制剂可从土豆﹑医用水蛭中提取,正常人体内并不存在。他们经动物实验(兔子)已经证实,TAFIa抑制剂PCI(取自土豆)与t-PA合用溶栓,可以显著地改善t-PA的溶栓疗效,可减少t-PA用量而又比较安全,不影响血压﹑APTT﹑TCT﹑纤维蛋白原的浓度。这一发现为临床降低溶栓治疗的出血并发症提供了新的希望。       综上所述,国外医学界对TAFI在体内的凝血-纤溶调控中的地位已给予高度重视,对TAFI的基础研究已深入到生理学﹑生物化学﹑基因学﹑免疫学﹑分子生物学等领域,并已能运用ELILA试剂盒等方法检测TAFI抗原水平,进行TAFI与血栓﹑TAFI与药物相关性等研究。尽管目前肯定性的结论不是太多,能应用于指导临床疾病防治的成熟方案还很少,但已开始在动物血栓模型上运用TAFI拮抗剂促进溶栓,取得较好疗效。当然,关于TAFI灭活缓激肽,TAFI与血管调节﹑与高血压的关系,与ACE的关系,与补体的关系等尚待进一步研究探讨。   致谢:   感谢北京协和医院血液科张之南教授、赵永强教授与《基础医学与临床》编辑部孙瑛老师对此文多次提出宝贵意见。   参考文献 :   〔1〕 Tilburg NH, Rosrndaal FR, Bertina RM, et al. 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