小肽缀合物(NNP)在大鼠心肌再灌注损伤中作用的实验研究

关键词  缺血再灌注损伤 自由基清除  抗凝血剂摘要   目的:大量自由基的产生可能是造成缺血再灌注损伤的主要原因之一。MDA(1,1,3,3-四甲氧基丙烷) 是脂质过氧化的最终产物,常用来作为评价大鼠心肌缺血再灌注损伤的指标。NNP是一种新合成的五肽缀合物,具有自由基清除和溶栓的双重活性。在这项研究中我们拟考察NNP是否对心肌缺血再灌注损伤有一定的保护作用。   方法:大鼠左冠状动脉阻塞30分钟,然后再灌注120分钟。NNP(10mg/kg) 或溶剂在缺血模型形成之前10分钟经颈静脉给药。再灌注结束后,快速取出心脏进行生化测定和病理组织学分析。   结果:缺血再灌注损伤之后MDA水平明显升高,GSH水平明显降低;NNP给药组显示MDA明显降低和GSH升高;另外,NNP给药组心肌的梗死面积明显减小。   结论:实验结果显示,氧化应激可造成缺血再灌注损伤,NNP可使梗死面积明显减小,并明显改善心脏抗氧化能力,从而缓解脂质过氧化造成的缺血再灌注损伤。对心脏缺血再灌注损伤的保护作 用可能源于NNP的自由基清除和溶栓的双重活性。    心肌缺血再灌注损伤是一个严重的,而又无法避免的问题。尽管对器官保护的加强和外科技术的提高,缺血再灌注损伤依然是临床面临的一个重要问题,对于它的防治具有重要意义,增强器官的抗氧化能力可能是减轻缺血/再灌注损伤的治疗方法。   根据这些,我们在研究中使用了一种新型合成的药物(NNP)(N-[1-(1,3-Dioxyl-4,4,55-tetramethyldihydro-imidazol-2-yl)phenyl-4-yl]oxyacetyl-GRPAK), 以往的研究表明,它具有自由基清除剂的活性和血栓溶解剂的活性,希望在预防给药中,能够减轻缺血再灌注损伤。 材料与方法   1.实验分组    雄性wistar 大鼠24只,体重250-300g , 饲养于安静的动物室内,温度控制在21±2℃,湿度控制在60±5%。实验分为3组:空白对照组;缺血再灌注+溶剂组;缺血再灌注+NNP组。溶剂和10mg/kg NNP在缺血前10分钟静脉给药。每组取8只大鼠用来测定心肌梗死面积和组织GSH(还原型谷胱甘肽)和MDA(1,1,3,3-四甲氧基丙烷)的水平。NNP用乙醇溶解,最终用生理盐水稀释至1%。   2.缺血-再灌注模型制备程序   大鼠腹腔注射1.2-1.4g/kg乌拉坦麻醉,颈静脉插管以备给药,气管插管进行人工呼吸,颈总动脉插管,并通过Harvard model 50-8952传感器(Harvard Apparatus,Inc., Massachusetts, U.S.A.)测定血压,采用Harvard Universal 笔式记录仪(Harvard  Apparatus,Inc., Massachusetts, U.S.A.)显示心电图。左侧于第4,5肋间开胸,并立即进行人工呼吸(1.5ml/100g, 60次/分)以保证pCO2、pO2和PH值正常。剪开心包,微微挤压使心脏暴露,6/0手术线快速置于左冠状动脉下,然后使心脏归位,稳定20分钟。外端手术线通过小塑料套管置于心脏内,拉动外端手术线头,可形成动脉阻塞,如放开则形成再灌。如果稳定过程中动物出现心律失常、血压持续下降到70mmHg以下,弃去不用。   3.组织死亡评价   动脉阻塞30分钟,然后再灌注120分钟。在缺血再灌之前的过程中监测血压、心电图、心率的变化。实验结束后,快速取出心脏,悬挂于Langendoff装置上,以生理盐水室温下灌流60秒。冠脉再次阻塞,然后灌注荧光染料,以标记梗死区(非荧光染料区域)。冰冻心脏,从心尖处开始, 把心脏横向切成4片,厚2mm.,将第2片起的切片,投入液氮中,并在-70℃保存,以备生化分析。为了评价组织死亡,切片置于1% 氯化四唑(TTC)中, 37℃孵育20分钟。非梗死区被染成深红色,而坏死区不着色,梗死区和危险区在紫外灯下不发出荧光。梗死区和危险区体积通过面积乘以切片厚度表示。梗死面积按文献报道方法,以占危险区百分数表示[2]。   4.生化测定   心脏标本在冰冷的150mM KCL 中匀浆,用来测定MDA。通过分光光度法测定上清中MDA,以硫代巴比妥酸激活底物百分率表示。GSH以分光光度法测定,采用ELman,s试剂。结果以nmol/g组织蛋白表示。 结  果   1.在实验前后,对照组与给药组之间平均动脉压和心率均没有显著差别。   在缺血或再灌注过程中,NNP给药组对血液动力学参数没有明显的影响(见表1)   表1  血液动力学指标
分组        稳定后  局部缺血后   再灌注30、60、120分钟
血压 (mmHg)
I/R+溶剂组       88±5    74±4    82±4   88±3   86±5
I/R+NNP组(10mg/kg)  78±4    67±5    76±3   83±3   81±3
心率 (次/分)
I/R+溶剂组      309±10   367±14   320±12  324±11  332±14
I/R+NNP组(10mg/kg)  315±12   326±13   328±13  330±15  322±11
   2.各组危险区、梗死面积和梗死面积/危险区比率。结果显示,NNP给药(10mg/kg,缺血前)能显著降低梗死率。(见表2)   表2  心肌梗死面积测定
组别危险区 (cm3)梗死面积 (cm3)梗死面积/危险区 (%)
I/R+溶剂组47±523±350±4
I/R+NNP组(10mg/kg)48±217±2a35±2a
   3.缺血/再灌注组MDA水平显著高于对照组,NNP能够显著降低MDA 数值的升高。缺血/再灌注组GSH水平低于对照组,NNP能够明显升高GSH水平。(见表3)   表3  NNP处理前后GSA、MDA水平测定
组别GSH (nmol/g)MDA (nmol/g)
对照组670±4056±6
I/R+溶剂组460±23144±10 a
I/R+NNP组 (10mg/kg)789±137 b50±30 b
   4.统计   数值均以平均值±标准差表示。每组n=8。I/R表示缺血/再灌注,a表示与对照组相比有显著差别(P<0.001,b表示与NNP给药组相比有显著差别(P<0.02 讨  论    缺血/再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程,涉及许多细胞内信号转导途径及细胞介质的释放。在手术过程中预防缺血/再灌注损伤是非常重要的。组织器官缺血/再灌注能够引起组织系统细胞因子和炎症介质的释放(包括肿瘤坏死因子-α、白介素-6、NO等),这些都可导致自由基的产生。缺血/再灌注常常引起过氧化损伤,进而导致自由基的产生、细胞内钙超载以及膜磷脂的降解,心肌内皮细胞白细胞侵润,增加反应性氧中间产物(ROS)的产生。当这些有害因素超过细胞内在自由基清除系统的能力,就会导致细胞的损伤和死亡。自由基引发的脂质过氧化与缺血/再灌注损伤有密切关系。MDA是脂质过氧化程度的指标,目前研究表明,缺血/再灌注能明显增加MDA水平。我们的结果显示NNP能够降低脂质过氧化和细胞的损伤,这种保护作用可能是由于这种合成药物能够清除高活性OH和OONO-的缘故。已知谷胱甘肽在细胞脂质过氧化损伤中起主要的保护作用,许多刺激物诱导的组织损伤与谷胱甘肽缺乏有关。早期的研究表明,组织内GSH可作为缺血后损伤程度的指标。GSH能够清除氧自由基,保护蛋白质硫氢键,免受氧化反应。GSH还能够恢复其他自由基清除剂和抗氧化剂(如维生素E和坏血酸素)至还原状态。在缺血/再灌注氧化应激过程中,GSH水平因消耗而下降。我们目前研究结果表明,应用NNP这种新型合成药后,能够明显升高缺血/再灌注过程中GSH水平的降低。   NNP是一种即有自由基清除剂,又有抗凝血剂双重作用的合成药物。研究表明,NNP具有直接清除一些自由基的作用如NO、H2O2和OH,不仅如此,它还能够对自由基清除剂起保护作用。在真球蛋白溶解实验、纤维蛋白溶解实验、乙酰胆碱诱导血管扩张实验和血栓溶解实验表明,NNP又具有溶解血栓的活性。因此,NNP在体外缺血/再灌注的心肌梗塞实验中具有心肌保护作用。本实验结果表明,NNP能够明显减小缺血/再灌注所致的心肌梗塞面积。与空白对照组相比,NNP能够明显降低缺血/再灌注时MDA升高的水平,明显升高缺血/再灌注时GSH降低的水平。这些结果表明,NNP能够减轻缺血/再灌注损伤。NNP的保护作用在于它具有自由基清除剂的活性和抗凝血剂的活性。我们推测NNP的保护作用可能在于它能够降低自由基介导的脂质过氧化以及增加抗氧化防御系统的能力。GSH水平作为机体抗氧化防御系统的一个指标,在缺血/再灌注组中明显降低,而在NNP治疗组中明显增高。同时,NNP作为抗凝剂有助于缺血/再灌注损伤的恢复。研究发现,这种具有双重活性(自由基清除剂的活性和抗凝血剂的活性)的合成剂与缺血/再灌注损伤中的GSH之间的关系。我们的结果显示这种合成制剂能够减少心肌缺血/再灌注所致的梗塞面积及增强抗氧化能力。结论,目前的研究表明,NNP具有心肌保护作用并且在心血管疾病的病生理过程中起关键作用。预防应用这种自由基清除剂和抗凝血剂,对于减轻缺血/再灌注损伤有一定的治疗作用。
    2008/10/22 13:34:42     访问数:1163
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2008/11/3 17:47:28
袁丕业:实验结果令人鼓舞。
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