MMP-2和TIMP-2在兔颈动脉粥样硬化斑块中表达的动态观察

关键词:动脉粥样硬化;MMP-2;TIMP-2;兔摘要   目的 观察MMP-2和TIMP-2在兔颈动脉粥样硬化斑块中表达的动态变化。   方法 高脂喂养加气体干燥术建立兔颈动脉内膜损伤模型,将实验动物分为正常对照组;高脂饲料加气体干燥术后1月组,2月组,3月组。用免疫组织化学法检测各组的MMP-2和TIMP-2表达情况。   结果 MMP-2和TIMP-2在普通饲料组兔颈动脉组织中低水平表达,高脂喂养加气体干燥术组兔颈动脉组织中表达水平升高。MMP-2总含量3月组>2月组>1月组,TIMP-2总含量1月组>2月组>3月组。MMP-2在斑块肩部的表达密度2月组>3月组>1月组,TIMP-2在斑块肩部的表达密度 1月组>3月组>2月组。   结论 就MMP-2和TIMP-2的动态变化来分析,斑块生长过程中同一斑块的不同部位的稳定性可能是不同的,斑块在生长过程中的稳定性是可能发生变化的。
   颈动脉粥样硬化是缺血性卒中的常见病因。颈动脉粥样硬化斑块脱落、斑块附壁血栓形成脱落以及在斑块基础上形成的血管狭窄是导致缺血性卒中的重要原因。细胞外基质合成的减少和降解的增加,是斑块破裂主要的内在原因,MMP-2对细胞外基质的降解是动脉粥样斑块不稳定的重要因素。本试验用高脂喂养加气体干燥术建立兔颈动脉粥样硬化模型,并观察兔颈动脉粥样硬化的形成过程中MMP-2和TIMP-2表达的动态变化。      材料与方法   1.1  材料   1.1.1  试验动物  雄性日本大耳白兔36只,体重2.3~3.0 kg,4个月龄,由第三军医大学实验动物中心提供。   1.1.2  主要试剂  胆固醇  花生油  精密气体流量计  兔抗大鼠MMP-2多克隆抗体  兔抗大鼠TIMP-2多克隆抗体   1.2  实验动物分组及不同处理   将动物按抽签法随机分为2组,分别为正常饲料组(=18),喂普通颗粒兔饲料;高脂饲料加气体干燥术组(=18),喂含按 2%胆固醇、6%花生油的颗粒兔饲料, 1周后实施颈动脉内膜气体干燥术,术后继续高脂饲料喂养,分别于术后第1月、第2 月和第3月各处死6只。所有动物均单笼喂饲,饮水不限,自由摄食,每日每只进食150g饲料。   1.3  内膜气体干燥术的实施   速眠新0.2ml/kg肌肉注射麻醉动物,颈部脱毛清洁消毒后,作颈正中切皮,于甲状软骨上方水平分离左侧颈总动脉,长约2.5cm,两端以动脉夹阻断血流。4.5号头皮针尽可能平行于血管纵轴方向穿刺阻断血管的两端,生理盐水冲洗置换出管腔内的血液后,接上已调节好流量为250ml/min的气流,历时5min造成内皮干燥,然后管腔内重新充满生理盐水,放开临时动脉夹恢复血流。湿润棉片轻轻压迫穿刺点3~5 min止血。庆大霉素滴于手术野中,缝合皮肤创口并包扎。术后肌注庆大霉素[1、2]。   1.4  血管造影颈动脉狭窄程度的判定   各实验组到达设计时间点后,速眠新0.2ml/kg肌肉注射麻醉动物,经右股动脉插管,肝素抗凝,使用300g/L的碘普罗胺造影剂行压力控制的颈动脉血管造影。以软件精确测量造影片每根   最狭窄区的最小残腔直径(DMS)和狭窄远端正常颈总动脉直径(DCC)。狭窄率=(DCC-DMS)/DCC×100% , 狭窄程度的判定:狭窄率<30%为轻度狭窄,30%~69%为中度狭窄,70%~99%为重度狭窄,100%为闭塞。   1.5  病理标本的留取    各实验组到达设计时间点后,速眠新过量麻醉动物,经心脏插管,4%多聚甲醛灌注固定后取下颈总动脉,4%甲醛固定后24 h后行常规石蜡切片,切片厚度5µm。   1.6  免疫组织化学检测   一抗MMP-2和TIMP-2购自武汉博士德公司,工作浓度为1:100,SP 9001免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。蜡片常规脱蜡至水。3%H2O2 室温5~10min,蒸馏水洗3次,微波热修复抗原,0.01ml/L PBS 缓冲液5 min冲冼3次。羊血清封闭37 ℃孵育20min,滴加一抗(1:100),37 ℃孵育过夜,0.01ml/L PBS缓冲液5min 冲冼3次。滴加生物素化羊抗兔二抗,0.01ml/L PBS缓冲液5min冲冼3次,37 ℃孵育20min,滴加辣根过氧化酶标记的链霉素卵白素液,37 ℃孵育15min,0.01ml/L PBS缓冲液5ml 冲冼3次。MMP-2用DAB显色,TIMP-2用AEC显色。镜下控制显色时间。苏木素复染,脱水,透明,封固。   1.7  结果判定   MMP-2和TIMP-2阳性表达为胞浆内或胞膜棕黄色颗粒,每张切片在400倍光镜下,在斑块的肩部、表面和全部各随机选取5个视野,利用Olympus BH2显微镜观察,在控制相同曝光强度和曝光时间的条件下拍照,Image pro plus 5.0软件进行灰度扫描,分别测定抗MMP-2和TIMP-2免疫沉淀物积分吸光度值(IA) ,取其平均值作为分析指标。分别比较普通颗粒兔饲料组和高脂饲料加气体干燥术组MMP-2和TIMP-2表达的差异。   1.8  统计学处理   应用SPSS12.0 统计软件,组间比较用配对样本t检验。      结果   2.1  一般情况    所有实验动物无中途死亡或患病,实验组动物未发现局部感染征兆,创口愈合良好。   2.2  颈动脉狭窄程度   所有颈动脉经血管造影后发现,普通饲料组及单纯高脂饲料组未见狭窄;高脂饲料加气体干燥术1月组6根血管狭窄程度均为轻度;2月组4根血管狭窄程度为中度狭窄,2根血管狭窄程度为轻度狭窄;3月组3根血管狭窄程度为重度狭窄,2根血管狭窄程度为中度狭窄,1根血管狭窄程度为轻度狭窄(图1-1、1-2、1-3)。
 
 
   图1-1 1月组        图1-2 2月组       图1-3  3月组   2.3 MMP-2和TIMP-2的表达结果   2.3.1  MMP-2的表达结果   MMP-2 在普通饲料组兔颈动脉组织中低水平表达,在高脂喂养组和高脂喂养加气体干燥术组兔颈动脉组织中表达水平升高(图2-1、2-2、2-3、2-4)。MMP-2总含量3月组>2月组>1月组,MMP-2在斑块肩部的表达密度 2月组>3月组>1月组,MMP-2在斑块表面的表达密度2月组>3月组>1月组。见表1。
 
  图2-1 正常对照组MMP-2 ×400        图2-2 1月组MMP-2 ×100
 
   图2-3 2月组MMP-2 ×200         图2-4 3月组MMP-2 ×100   表1 MMP-2的表达结果(OD ±SD)
 肩部表面全部
正常对照组35.16±5.2135.16±5.2135.16±5.21
损伤后1月组78.76±15.03119.42±14.82125.06±16.31
损伤后2月组138.16±14.53☆☆128.86±16.90146.56±14.77
损伤后3月组121.41±16.18**※※122.46±17.12**184.03±13.89**※※
   ☆:p<0.05 损伤后2月组与损伤后1月组比较   ☆☆:p<0.01 损伤后2月组与损伤后1月组比较   **:p<0.01 损伤后3月组与损伤后2月组比较   ※※: p<0.01 损伤后3月组与损伤后1月组比较   2.3.2 TIMP-2的表达结果   TIMP-2 阳性表达AEC显色法为胞浆内或胞膜红色颗粒。TIMP-2在普通饲料组兔颈动脉组织中低水平表达,在高脂喂养加气体干燥术组兔颈动脉组织中表达水平升高(图3-1、3-2、3-3、3-4)。TIMP -2总含量1月组>2月组>3月组,TIMP-2在斑块表面的表达密度 1月组>3月组>2月组,TIMP-2在斑块表面的表达密度1月组>3月组>2月组。见表2。   表2 TIMP-2的表达结果(OD
±SD)
 肩部表面全部
正常对照组34.53±8.7634.53±8.7634.53±8.76
损伤后1月组173.63±23.35141.06±15.75159.27±13.24
损伤后2月组133.11±18.46☆☆112.04±14.03☆☆148.58±10.43
损伤后3月组164.61±20.29**118.49±7.89*146.97±17.37*
   ☆:p<0.05 损伤后2月组与损伤后1月组比   ☆☆:p<0.01 损伤后2月组与损伤后1月组比较   *:p<0.05 损伤后3月组与损伤后2月组比较   **:p<0.01 损伤后3月组与损伤后2月组比较   ※: p<0.05 损伤后3月组与损伤后1月组比较
  
   图3-1 正常对照组TIMP-2 ×400    图3-2 1月组TIMP-2 ×100
  
   图3-3 2月组TIMP-2 ×200      图3-4 3月组TIMP-2 ×100      讨论   MMPs/ TIMPs 二者之间的平衡共同调节细胞外基质的降解和合成,细胞外基质合成的减少和降解的增加,是斑块破裂主要的内在原因。在对未破裂斑块和已破裂斑块的大量研究中发现,已破裂斑块的MMPs升高[3]。许多证据表明MMP-2在人的动脉粥样硬化斑块中表达增高,他们参与了胶原和纤维帽的降解。有症状颈动脉粥样硬化斑块中MMP-2的含量高于无症状颈动脉粥样硬化斑块,MMP-2表达增高和决定斑块稳定性的斑块形态及机械因素有相关性[4]。在MMPs相互作用或与其它蛋白酶如纤维蛋白溶酶作用发生激活级联反应中,MMP-2是个关键酶。   MMPs的主要生理性抑制剂是TIMPs,TIMPs是一个低分子量分泌型蛋白质家族, 目前已确定了4种TIMPs(TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4),每一种都可与几种MMPs以共价键形式生成1:1复合物,对活性MMPs具有专一的抑制作用[5]。TIMPs对MMPs活性的抑制作用是MMPs活性的重要调节机理。TIMP-2是分子量为21KD的非糖基化的蛋白质,最先是从黑色素瘤细胞中分离出来的,它是MMP-2的内源性特异性抑制因子。   正常血管壁的内皮细胞不能分泌MMP-2。内皮细胞损伤后,细胞因子、局部缺氧、氧化低密度脂蛋白、血小板活化因子等可诱导内皮细胞分泌MMP-2。血液循环中的单核细胞与内皮细胞黏附,在血管壁中迁移、吞噬脂质后,在演化为巨噬源性泡沫细胞的过程中分泌大量MMP-2。在平滑肌细胞泡沫化的过程中,也可分泌大量的MMP-2。血管壁的机械牵张力可以通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的介导而增加MMP-2 的mRNA 表达和其酶原的释放〔6〕,血流动力学的不稳定、血管壁侧压力和切应力的变化,是导致MMP-2 分泌的重要原因〔7〕。TIMP-2多随MMP-2表达而表达,在有些细胞(如成纤维细胞)中是与MMP-2酶原形成复合物的形式被分泌出来,而在另一些细胞(如肺泡巨噬细胞)中则以非结合的形式分泌出来。多种生长因子和细胞因子能调节TIMPs转录[8],如表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、PDGF、FGF、IL-1、IL-6、TNF-β、佛伯酯可上调TIMPs,IL-4可下调TIMPs,TNF-α与TIMPs呈剂量依赖,既可上调TIMPs,又可下调TIMPs。   本研究发现,MMP-2、TIMP-2在普通饲料组兔颈动脉组织中低水平表达,在高脂喂养加气体干燥术组兔颈动脉组织中表达水平升高。正常血管壁的平滑肌细胞MMP-2、TIMP-2低水平表达,正常血管壁的内皮细胞不能分泌MMP-2、TIMP-2。MMP-2、TIMP-2在损伤组内皮细胞及形成中的平滑肌源性泡沫细胞中高水平表达。MMP-2、TIMP-2在斑块肩部、表面表达密集。MMP-2和TIMP-2的浓度表达变化趋势并不完全一致,从总体的趋势来看,随着时间的延长,MMP-2的浓度表达趋势是逐渐升高的,而TIMP-2的浓度表达趋势是逐渐降低的。分区域来看,2月组MMP-2在斑块表面和肩部的表达密度在3组中是最高的,且2月组TIMP-2在斑块表面和斑块肩部的表达密度在3组中是最低的。而斑块的表面和肩部是最易受到血液动力学因素、血流成分、炎性因子等的影响区域,也是斑块不稳定性易发生变化的区域,我们由此可推断就MMP-2和TIMP-2来说,2月组斑块的表面和肩部在3个组中降解斑块中的胶原和细胞外基质的力量相对是最强的,而抑制其降解的力量相对是最弱的。而从斑块整体来说3月组斑块在3个组中降解斑块中的胶原和细胞外基质的力量相对是最强的,而抑制其降解的力量相对是最弱的。这间接证明了同一斑块的不同部位降解胶原和细胞外基质的力量和抑制其降解的力量是不平衡的,同一斑块的不同部位的稳定性可能是不同的,斑块在生长过程中的稳定性是可能发生变化的。   参考文献   1.徐永革,周定标,郑集,等. 颈动脉粥样硬化性狭窄动物模型的建立[J].中华神经外科杂志, 2003, 19(4):255-258.   2.Chen-X,Ren-S, Ma-M-G,et a1.Hirulog-like peptide reduces restenosis and expression of tissue factor and transforming growth factor-beta in carotid artery of atherosclerotic rabbits. Atherosclerosis[J]. 2003,169(1): 31-40.   3.Van-der-Wal,-A-C; Becker,-A-E. Atherosclerotic plaque rupture--pathologic basis of plaque stability and instability, Cardiovasc-Res[J]. 1999 , 41(2): 334-344.   4.Whatling, Carl; McPheat, William;et al. Eva Matrix Management: Assigning Different Roles for MMP-2 and MMP-9 in Vascular Remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis & Vascular Biology[J]. 2004, 24(1):10-11.   5.Keith Brew, Deendayal Dinakarpandian, Hideaki Nagase. Tissue inhibitors of metalloproteinases: evolution, structure and function. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology[J]. 2000, 1447(1-2): 267-283   6.Grote K,Flach l,Luchtefeld M,et al. Mechanical stretch enhances mRNA expression and proenzylne release of nmtrix metalloproteinase-2 (MMP-2) via NAD(P)H oxidase-derived reactive oxygen species[J].Circ Res,2003,92(11):80-86.    7.Ishikawa Y,Asuwa N,Ishii T,et a1.Vascular remodeling by hemodynamic factors.Virchowa Arch[J],2000,437(2):138-l48.    8.Hoashi T, Kadono T, Kikuch i K, et al. Differential growth regulation in human melanoma cell lines by TIMP-1 and TIMP-2. Biochem Biophys Res Commun, 2001; 288 (2)∶371  
    2008/10/17 10:09:27     访问数:1046
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2008/10/18 10:19:01
吴奇志:非常好。
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