LncRNA TUG1 在冠状动脉粥样硬化性心脏病患者血清中的表达及意义

作者:潘洪川[1] 
单位:四川省眉山市人民医院[1]

  动脉粥样硬化是一种由脂质代谢异常、慢性炎症、免疫紊乱及遗传等多种因素相互作用下发生的一种慢性代偿性炎症反应,是许多心血管疾病的病理基础;其病程涉及脂质在血管内膜沉积、内皮细胞受损、血小板和白细胞(单核细胞)黏附侵袭伴平滑肌细胞和胶原纤维增生、泡沫细胞的形成。单核细胞粘附、迁移到内皮层下引发炎症反应被认为是动脉粥样硬化的始动环节,也是防止动脉粥样硬化的重要靶点1, 3。研究发现 IGF2BP参与动脉粥样硬化炎症反应。我们通过生物信息学分析发现LncRNA TUG1可能影响IGF2BP的表达,从而我们推测LncRNA TUG1可能通过调节IGF2BP表达从而影响动脉粥样硬化炎症反应。本研究旨在研究LncRNA TUG1在动脉粥样硬化炎症反应中的作用及意义。


材料和方法


  1.1 研究对象

  选取2014年10月至 2015 年12月期间相继在我院心内科就诊的患者,包括106例冠心病阳性病例和97例冠心病阴性对照。冠心病组:冠状动脉造影手术显示有一支以上狭窄≥75%的患者。其中男性67例,女性39例,年龄35-88岁,中位年龄59岁。对照组:选择同期就诊、冠状动脉造影手术显示狭窄≤25%的患者。其中男性49例,女性48例,年龄32-85岁,中位年龄56.8岁。所有患者间无血缘关系。采集外周血液样本同时收集样本临床资料,包括:性别、年龄、是否患有高血压、是否患有高血脂、是否患有糖尿病、是否发生过心肌梗死。所有入选病例确诊后即刻用含抗凝剂的紫色采血管采集静脉血静置于 4℃冷藏 30min后,室温下 3000rpm 离心 15min,留取上层血清,置于-80℃冰箱备用。所有患者均签署知情同意书, 经我院伦理委员会批准。


  1.2 血清总RNA提取

  将分离所得血清,置于冰上融化;取 250μl 血清样品,加入 750μl Trizol,振荡器混匀,静置 5min;加入 200μl 氯仿,振荡器混匀,静置 10min;室温下离心 12000rpm、10min,留取上清液并量取其体积,转移至另一个无 Rnase 的 EP 管中;分别加入与上清液等体积的异丙醇,振荡器振荡混匀,室温下静置 3min;室温下离心 12000rpm 、10min;倒出管内液体,加用 1ml 75%乙醇;室温 12000rpm 离心 2min;倒出乙醇,并用 Tip 枪头将剩余液体吸干净,晾干。每管中加入 10μl 无 Rnase 的 ddH2O,以能够充分溶解 RNA;用分光光度计测定总 RNA 浓度及纯度。


  1.3 Real-time PCR分析LncRNA TUG1的表达水平

  提取血清总RNA,逆转录反应参照AMV 逆转录试剂盒说明,在 20μl 体系中加 2μg 总 RNA进行 cDNA 的合成。Real-time PCR 采用2xSYBR Green PCR Master Mix,取适量cDNA 作为摸板,引物浓度 0.4μmol/L,15μl 体系进行扩增,每个待测样本设置 3 个平行样,根据目标基因设计合成相应上下游引物进行 PCR扩增,以GAPDH 作为内参照。PCR 反应在定量 PCR 反应仪上进行。三次独立实验后得到的数据运用公式 RQ=2-ΔΔCt 的方法进行分析。


  1.4 血清IGF2B、IL6、TNF-a的检测

  血清IGF2B、IL6、TNF-a均采用酶联免疫吸附法(ELISA)。酶联免疫分析试剂盒由上海华壹生物技术有限公司提供, 实验严格按试剂盒说明进行操作。


  1.5 采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析。

  血液标本中TUG1、IGF2B、IL6、TNF-a 的表达差异采用t检验或One-way ANOVA方差分析,用±s表示;TUG1与IGF2B、IL6及TNF-a相关性分析采用线性回归法。以P<0.05为差异具有统计学意义。


结果

  2.1冠状动脉粥样硬化性心脏病阳性患者与对照者血清TUG1表达水平检测106 例冠状动脉粥样硬化性心脏病阳性患者和98 例阴性对照者基本信息见表1。与CAD阴性患者相比, CAD阳性患者血清TUG1表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.0 5) (图1A,B)。


表1 比较冠状动脉粥样硬化性心脏病阳性组和阴性组患者一般临床资料
Table 1 Comparison of the clinical characteristic between CADand control groups

 

图1. QRT-PCR分析冠状动脉粥样硬化性心脏病患者血清TUG1的表达
Fig 1. Serum TUG1expression of in CAD patients by QRT-PCR


  2.2冠状动脉粥样硬化性心脏病患者血清IGF2B、IL6及TNF-a表达情况

  冠心病阳性组血清IGF2B、IL6及TNF-a浓度分别为( 121.20士12.48 ) ng/mL、( 150.65士11.48 ) ng/mL和(160.56士11.175) ng/mL,显著高于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05) (图2)。

 


图2. 冠状动脉粥样硬化性心脏病患者血清IGF2B、IL6及TNF-a表达情况
Fig2. The expression of IGF2B、IL6 and TNF-a in CAD patients


  2.3 血清TUG1与IGF2B、IL6及TNF-a表达的相关分析

  线性相关分析108例CAD阳性患者血清TUG1与IGF2B、IL6及TNF-a的表达的相关性,结果提示TUG1与IGF2B、IL6及TNF-a的表达呈负相关关系(IGF2B r= -0.767, P<0.001,IL6,r=-0.671, P<0.001,TNF-a,r=-0.872, P<0.001,图3A,B,C)

 

图3 血清TUG1的表达与IGF2B、IL6及TNF-a的相关性
Fig 3. The relationship of TUG1 expression with serum IGF2B、IL6 and TNF-a.


讨论

  炎症贯穿冠状动脉粥样硬化性心脏病发生进展的整个病理生理过程,是遗传因素和环境因素共同作用的结果,是导致动脉粥样硬化斑块形成和不稳定的中心环节6, 7。众所周知,人类基因组中的可转录本超过90%,但是其中只有大约2%为蛋白编码基因。这意味着非编码RNA(Non-coding RNAs, ncRNAs)是哺乳动物转录组中的重要组成部分,在这些非编码RNA中,长度为21-23nt的微小RNA(micro RNA,  miRNA)已被证明在多种生物及病理学过程中发挥着重要作用。长链非编码RNA(Long  Non-coding RNAs, LncRNAs)及其亚型基因间长链非编码RNA,这一类长度超过200nt的ncRNA,近年来亦被证明是非编码RNA中可发挥生物学功能的重要组分2, 4。众多研究结果提示在肿瘤的发生发展过程中,LncRNAs均有参与并发挥重要作用,然而LncRNAs在心血管系统疾病中的作用却尚不十分清楚5, 8。近年来的研究发现 IGF2BP参与动脉粥样硬化炎症反应。我们通过生物信息学分析发现LncRNA TUG1可能影响IGF2BP的表达,从而我们推测LncRNA TUG1可能通过调节IGF2BP表达从而影响动脉粥样硬化炎症反应。本研究通过QRT-PCR检测我院收治的106例冠心病阳性病例和98例冠心病阴性对照组血清TUG1的表达水平, 酶联免疫吸附法检测外周血清中IGF2B、IL6、TNF-a的浓度。分析其TUG1与血清IGF2B、IL6、TNF-a表达水平的相关性。结果发现冠心病阴性组比较,冠心病阳性组患者血清TUG1维持在相对较低的水平。而IGF2B、IL6、TNF-a在CAD阳性组患者血清中的表达水平明显高于CAD阴性组(P<0.05)。相关分析发现血清TUG1与IGF2B、IL6及TNF-a的表达呈负相关关系(IGF2B r= -0.767, P<0.001,IL6,r=-0.671, P<0.001,TNF-a,r=-0.872, P<0.001 )。以上研究结果提示,LncRNA TUG1有望成为新的早期诊断CAD的血清学指标,可作为CAD早期诊断和鉴别标志物,具有较好的临床应用前景,然而其具体机制仍需进一步深入研究。


参考文献:略


    2020/2/5 20:57:50     访问数:85
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