基于内质网应激-自噬的豁痰解毒通络饮干预兔颈AS的机制研究

作者:邓悦[1] 于克英[1] 石锐[1] 
单位:长春中医药大学附属医院[1]

  动脉粥样硬化( atherosclerosis,As)是冠心病、卒中等心脑血管疾病的重要始动因素,AS斑块的破裂,引发的脑梗死、心肌梗死等疾病具有很高致死率,故AS的防治及其机制研究至关重要。内质网应激( endoplasmic reticulum stress,ERS)及其引起的自噬(autophagy ) ,即ERS-自噬可能参与了包括心血管疾病,糖尿病等在内的多种疾病的发生发展[1]。而AS斑块中亦存在ERS-自噬,在AS早期ERS-自噬是机体应激状态下的保护机制,但是过度激活又会加剧AS的进一步发展,故研究其在AS中的作用及其机制意义重大。本研究拟用2%L-蛋氨酸喂养联合颈总动脉球囊损伤的AS模型,研究ERS-自噬对于AS的作用机制,明确中药豁痰解毒通络饮对于AS及ERS-自噬信号通路的干预作用。


1.材料

  1.1 动物及饲料 雄性日本大耳兔,2月龄,体重1.9-2.1kg,购于北京维通利华实验动物科技有限公司,许可号:SCXK(京)2015-0001,饲养于北京东直门医院中医内科重点实验室(伦理委员会批号:2017-067)。2% L-蛋氨酸兔饲料(北京科澳协力饲料有限公司,批号:GDAF161217)。


  1.2 药物及试剂 豁痰解毒通络饮(包含瓜蒌、水蛭、金银花等),长春中医药大学附属医院新绿色颗粒药房提供。阿托伐他汀(辉瑞制药,Lot:H20051408)。一抗:GRP78(origene,Lot:TA309341);DDIT3(Aviva Systems Biology,Lot:ARP31591_P050),Atg12(mybiosource,Lot:MBS448066);β-actin(abcam,Lot:ab8226);二抗(proteintech,Lot:SA00001-3)。


2.方法

  2.1 建模 雄性日本大耳兔24只随机分为假手术组,模型组,HTJDTLD组(6.67g·kg-1/d),阿托伐他汀组(1.42mg·kg-1/d),每组6只。假手术组用维持饲料,其余组2% L-蛋氨酸饲料喂养(150g/d),2周后球囊损伤颈总动脉内膜,再喂养4周建立AS模型。


  2.2  HE染色 麻醉后,取颈总动脉,4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋并切片染色。光镜下观察动脉内膜增生情况。


  2.3  ELISA法 麻醉后,腹主动脉无菌取血,室温放置2h,离心1000×g,20min,取上清,按照ELISA试剂盒说明书操作。


  2.4  RT-PCR检测方法 液氮研磨组织,使用TaKaRa RNA提取及反转录试剂盒提取RNA,并反转录为cDNA。以β-actin为内参,采用2-ΔΔCt 法计算Atg12 mRNA在各组的相对表达量。Atg12:上游5’- CGACATCCTGCTGAAGGCTGTG-3’,下游:5’-AGTCCTTGGATGGTTCTTGTTCGCG-3’,87bp;β-actin:上游5’-GGCATGGAGTCGTGTGGCATC-3’,下游:5-CGTGTTGGCGTACAGGTCCTTG-3’, 90 bp(大连宝生物有限公司)。


  2.5蛋白免疫印记法(Western blot) 取颈总动脉,裂解液充分裂解,使用SDS-PAGE电泳,转膜用湿转法。超敏ECL显色试剂盒显色后,ECL成像仪拍照,Image J软件分析灰度值。


  2.6 统计方法 使用SPSS22.0统计分析软件,符合正态分布的数据以平均值±标准差(x±s) 表示,若方差齐性多组间比较用单因素方差分析。


3.结果

  3.1 颈总动脉狭窄情况 光镜下可见,假手术组内膜光滑,为正常血管内膜的形态。与假手术组比较,模型组有明显的内膜增生与损伤,管腔明显变窄;与模型组比较,HTJDTLD组、阿托伐他汀组内膜增生与损伤程度明显减轻,有轻微的内膜增生(见图1)。

 

  注:A:假手术组;B:模型组;C:HTJDTLD组;D:阿托伐他汀组

图1兔颈总动脉动脉狭窄情况 (×40μm)


  3.2 血清中Hcy含量 与假手术组比较,模型组Hcy的水平明显升高(P<0.01);与模型组比较,HTJDTLD组、阿托伐他汀组中Hcy水平明显降低(P<0.01)(见图2)。

 

  注:与假手术组比较**P<0.01;与模型组比较##P<0.01。

图2  血清中Hcy的含量


  3.3  Atg12 mRNA水平 与假手术组比较,模型组Atg12 mRNA水平明显升高(P<0.01);与模型组比较,两个药物组Atg12mRNA的水平明显降低(P<0.01)(见图3)。

 

  注:与假手术组比较**P<0.01;与模型组比较##P<0.01。

图3 Atg12mRNA表达水平


  3.4  GRP78、DDIT3、Atg12的蛋白表达水平 与假手术组比较,模型组中GRP78、DDIT3、 Atg12的蛋白表达均升高(P<0.01);与模型组比较,HTJDTLD组、阿托伐他汀组三者的蛋白表达均降低(P<0.01)(见图4)。

 

  注:A:假手术组;B:模型组;C:HTJDTLD组;D:阿托伐他汀组;与假手术组比较**P<0.01;与模型组比较##P<0.01。

图4 GRP78、DDIT3、 Atg12蛋白表达水平


4.讨论

  ERS是细胞对损伤刺激的适应性反应,可以维持细胞内环境的稳态,具有一定的保护性作用,但是过度激活又会加剧细胞的损伤,诱导自噬的发生[2]。GRP78是内质网中的驻留蛋白,是ERS反应中的标志性分子。ERS的过度激活会加剧相关蛋白C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的过表达,诱导细胞凋亡的发生[3],CHOP又被称作DDIT3,可以对很多自噬相关蛋白进行调控。而ERS 增强后激活PERK-eIF2a通路上调自噬相关蛋白Atg12的表达可能参与了自噬的发生 [4]。Hcy 能够剂量依赖性上调ERS中UPR 效应分子GRP78、ATF6 蛋白水平[5],是ERS的激活剂。本研究使用2%的L-蛋氨酸饲料喂养导致HHcy,进而引发ERS-自噬的发生。


  阿托伐他汀可以改善血管内皮功能,抑制炎症反应,减少氧化应激,逆转AS,临床疗效显著[6],还能够抑制Hcy 诱导的Nox1依赖性的活性氧的生成和p38MAPK 通路的激活,抑制AS的发生发展[7],故本研究选其作为阳性对照药。豁痰解毒通络饮是根据中医“痰瘀伏络”学说拟定的经验方,由红景天、金银花、当归、水蛭、瓜蒌等9为药物组成。痰瘀伏络是在伏邪学说基础上发展而来,伏邪学说最早见于《内经》。国医大师任继学教授指出:“伏邪即隐藏于人体之虚处”[8]。本研究认为AS引起的血管壅塞不通,为痰瘀伏络,蕴结成毒所致。年老体衰,脏腑功能低下,水湿运化失常、内生痰浊,日久化瘀,潜伏于络脉,日久成毒,故痰瘀毒伏于络脉是关键病机,针对这一关键病机,临床上用豁痰解毒通络饮加减治疗,疗效显著[9]。本研究中, HTJDTLD组能改善内膜增生状况,降低血清Hcy含量,且能够降低GRP78、DDIT3、Atg12蛋白水平及Atg12基因水平,说明HTJDTLD在治疗兔AS及HHcy效果显著,且HTJDTLD可能通过抑制ERS-自噬的过度激活,进而减缓AS的进程,为中医药治疗AS提供新的靶点。

 

参考文献:略


    2020/1/3 17:20:47     访问数:199
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