中药复方豁痰解毒通络饮干预兔颈总动脉PTCA术后AS内质网应激-自噬机制研究

作者:邓悦[1] 于克英[1] 
单位:长春中医药大学附属医院[1]

  目的:建立兔颈总动脉内膜损伤术后动脉粥样硬化(AS)模型,模拟临床中PTCA术后再狭窄的AS,观察研究豁痰解毒通络饮对此模型的干预作用,探讨豁痰解毒通络饮是否可能通过内质网应激(ERS)-自噬信号通路抑制动脉粥样硬化的进展。


  方法:10周龄雄性日本大耳兔30只,随机分为5组,每组6只,分别为假手术组、模型组、中药组、西药组、中药高剂量组。除了假手术组用普通饲料喂养外,其余各组均用2%L-蛋氨酸饲料喂养先行喂养2周后,再行球囊损伤兔左侧颈总动脉内膜术,建立兔颈总动脉AS模型。假手术组、模型组给予正常饮用水灌胃,中药组给予豁痰解毒通络方灌胃,西药组给予阿托伐他汀灌胃,中药高剂量组给予高剂量豁痰解毒通络方灌胃,各组灌胃给药4周后取材。1.血管超声检测:分别选取假手术组左侧、模型组右侧、模型组左侧(损伤侧)各5个颈总动脉的进行超声检测,拍照后测量颈总动脉内膜-中膜深度,每根血管选3个测量点,分别为颈总动脉远心端、颈总动脉近心端、以及两者中点位置进行测量。2.酶联免疫吸附测定法(ELISA):①检测模型组0周、2周、6周三个时间段的兔血清中同型半胱氨酸(Hcy)的含量;②第6周各组血清中同型半胱氨酸(Hcy)、活性氧簇(ROS)、总胆固醇(TC)的含量。3.病理学检测:①HE染色检测各组取损伤侧颈总动脉内膜增生情况;②Masson染色观察颈总动脉血管各层胶原纤维表达情况;③免疫组织化学染色方法检测各组损伤侧颈总动脉eIF2a的表达情况;④电镜检测各组兔颈总动脉内膜超微结构。4.实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测:①各组兔颈总动脉组织中的内质网应激标志分子GRP78 、PERK、eIF2a的mRNA水平;②各组动脉组织中自噬标志分子beclin1、 Atg12、ULK1的mRNA水平。5.蛋白免疫印记法(Western blot)检测:ERS标志分子GRP78 、PERK、eIF2a、p-eIF2a,以及自噬标志分子beclin1、Atg12、ULK1在颈总动脉组织中的蛋白分子的表达水平。


结果:1.血管超声结果示:与假手术组左侧、模型组右侧相比,模型组左侧的内膜-中膜深度明显增宽,血管内-中膜增生极其明显,统计学差异极显著(P<0.01),模型组右侧与假手术组左侧组间比较无统计学差异(P>0.05),各组中远心端、中点、近心3个测量点的结果一致,组间比较无统计学差异(P>0.05)。


  2. ELISA检测结果示:①模型组血清中Hcy的含量2周明显高于0周(P<0.01); 6周与0周比较血清中Hcy的含量明显升高,有极显著差异(P<0.01),与2周比较,血清中Hcy的含量亦有所升高(P<0.05);②6周时各组血清Hcy的含量检测结果显示:模型组与假手术组比较,血清中Hcy的水平显著升高(P<0.01);中药组、西药组、中药高剂量组与模型组相比较, 血清中的Hcy水平显著降低(P<0.01)。


  3.病理学检测:① HE染色结果:与假手术组比较,模型组有明显的内膜增生、外膜炎性细胞浸润;三组药物组与模型组比较,内膜增生与损伤程度明显减轻,外膜炎性浸润减轻,介于假手术组和模型组之间;② Masson染色检测结果示:假手术组颈总动脉Masson染色后呈现以红色的肌纤维为主,未见明显的胶原纤维;模型组兔颈总动脉有明显的内膜增生,内膜、中膜、外膜都呈现了不同程度的蓝染,胶原纤维明显增多;三组药物组与与模型组比较,胶原纤维显著减少,内膜增生减轻。③ 免疫组化检测结果:假手术组eIF2a的表达呈阴性,胞核颜色基本为蓝色;模型组与假手术组比较,内膜明显增厚,新生内膜中eIF2a的表达呈阳性,可见大量棕黄色颗粒;而三组药物组中可见少量棕黄色颗粒,eIF2a的表达与模型组比较明显减少。④ 电镜观察结果表明:假手术组兔颈总动脉内膜中无自噬空泡聚集,可见少量脂滴;与假手术组相比,模型组颈总动脉内膜中自噬空泡明显增多,可见大量自噬溶酶体;三组药物组自噬体较模型组显著减少。


  4.RT-PCR检测结果示:与假手术组比较,模型组兔颈总动脉组织中ERS标志分子GRP78 、PERK、eIF2a,自噬标志分子beclin1、 Atg12、ULK1的mRNA水平显著升高(P<0.01);中药组、西药组、中药高剂量组与模型组相比,GRP78 、PERK、eIF2a、beclin1、 Atg12、ULK1mRNA的水平显著降低(P<0.01)。


  5.Western blot结果显示:与假手术组比较,模型组中的ERS标志分子GRP78 、PERK、eIF2a、p-eIF2a,以及自噬标志分子beclin1、Atg12、ULK1的蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,三组药物组颈动脉组织中GRP78 、PERK、eIF2a、p-eIF2a、beclin1、Atg12、ULK1的蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。


  结论:1.成功建立兔颈总动脉球囊损伤术后AS模型,成模率高,病变恒定,可用于模仿人类PTCA术后再狭窄的机制研究。2. 豁痰解毒通络饮可以明显改善兔颈动脉粥样硬化,对球囊损伤后的内膜增生有明显抑制作用。 豁痰解毒通络饮能够降低兔血清中Hcy的含量。3. 内质网应激(ERS)-自噬信号传导通路分子在球囊损伤术后AS模型中的过度表达,中药复方豁痰解毒通络饮能够抑制ERS-自噬通路的过度激活,为治疗PTCA术后AS提供新的治疗靶点和理论依据。


    2019/8/15 19:14:14     访问数:312
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