糖尿病动物模型在减重代谢外科基础研究中的初步应用

作者:邱先杰[1] 李伟正[1] 杨湘武[1] 
单位:中南大学湘雅三医院[1]

  近年来2型糖尿病(type2diabetesmellitus,T2DM)在全球范围患病率快速增长,总量已达4.15亿,中国以1.09亿居于第一[1]。有证据表明[2]合并T2DM的肥胖症患者行Roux-en-Y胃旁路术(Roux-en-Ygastricbypass,RYGB)后80%~90%糖尿病可治愈或好转,代谢手术作为T2DM治疗方案:国际糖尿病组织联合共识[3]有充足的临床证据支持将代谢手术纳入肥胖合并T2DM的降糖干预措施中,并得到45个国际组织的官方支持和认可。然而,其机制未完全阐明亟待研究,为减重代谢外科(metabolicandbariatricsurgery,MBS)干预时机的选择、减少治疗可能带来的副作用等提供证据。实验研究需要的基本条件可概括为:实验动物、设备、信息、试剂四要素,目前标准实验动物中以小型哺乳动物易于诱导病理、功能变化,其中又以大鼠重复性好、便于管理、经济、手术操作难度适中等优点应用较广泛。故本文以大鼠为主,从常用的糖尿病(diabetesmellitus,DM)动物模型介绍、在减重代谢领域的初步应用、总结与展望三个方面进行综述。


一、MBS基础研究常用实验动物模型分类及特点


  目前常用模型按实验动物是否具备糖尿病或肥胖症可分为肥胖糖尿病型、非肥胖糖尿病型、肥胖非糖尿病型、非肥胖非糖尿病四种类型[4],国内则有学者根据模型发病机制分为自发型、实验型、转基因型[5]。两种分类方法侧重不同,但互有交叉,如第一种方法的前三者多属于自发型DM模型,非肥胖非糖尿病型也可称实验型DM模型。实验型是用各种生物、物理或化学方法造成胰岛β细胞损伤导致胰岛素分泌缺乏引起DM。最早的DM动物模型即属于实验型,是由Mehring和Makowski[44]在1890年使用胰腺切除法建立,限于严重的手术创伤以及胰腺外分泌障碍等副作用,促进了自发型的寻找,以及20世纪80年代转基因型的发展,下面对应用广泛者的特点予以简介。


  肥胖糖尿病型中应用最广泛为ZDF大鼠(zuckerdiabeticfatty,ZDF),由封闭群Zucker大鼠突变后净化近交繁育而来,特征是肥胖、骨骼肌胰岛素抵抗及胰岛素分泌不足且胰腺β细胞易缺乏,分子机制主要是胰腺β细胞上的葡萄糖转运子-2受体的低表达,雄性在7~10周龄自发成肥胖合并T2DM。非肥胖糖尿病型以GK大鼠(Goto–Kakizaki,GK)多见,后者由口服糖耐量实验异常的Wistar大鼠近亲繁殖培育[45]。GK大鼠的特征为消瘦、肝脏胰岛素抵抗、高胰岛素血症及胰腺β细胞缺乏,分子机制是早期胚胎发育期间胰腺生长因子缺乏,胰腺β细胞增殖能力缺失,故两周龄时即可自发成DM。ZF大鼠(zuckerfatty,ZF)的特征为肥胖、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、高血脂等,属于肥胖非糖尿病型,有研究表明[4],ZF大鼠受常染色体隐性基因fa影响,血脑屏障上瘦素载体减少,导致摄食和机体能量平衡被打破。最后Wistar等[46]非肥胖非糖尿病型目前多通过链脲佐菌素(streptozocin,STZ)诱导出DM状态。STZ是一种由链球菌产生的天然化合物,在用于抗菌、抗肿瘤的同时发现有选择性进入胰岛β细胞,烷化DNA,对胰岛β细胞产生毒性作用[6],诱导多种动物产生DM。Reed等[8]在20世纪90年代联合高脂饮食(highfatdiet,HFD)诱发SD大鼠(spraguedawley,SD)DM的方法,经过国内外学者十余年时间的工作和改进[9-11],模型病理、生理改变都更加接近人类T2DM。一般认为[12]改进后高脂高糖饮食联合小剂量STZ诱发DM的方法(以下简称小剂量STZ法),具有高血糖、高血脂、外周胰岛素抵抗、胰岛素相对分泌不足特征,如果HFD时间长还可诱导出肥胖状态。该方法HFD2~8周,STZ用量25~60mg/kg均有文献报道建模成功[13-15]。然而有研究表明HFD喂养6周是利用45%脂供能高脂饲料构建SD大鼠肥胖模型最为经济的建模周期[16]。而更为关键的STZ用量,笔者所在团队反复摸索的经验是将HFD后部分大鼠提前3~5d腹腔注射STZ(HFD6周者可考虑30~34mg/kg),模型血糖达到预期标准者用量即为最优STZ剂量。


  目前DM动物模型建模成功的判断标准不一。总结糖尿病动物建模有关文献[17-19],结合目前临床上采用的世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)诊断标准,可从以下两方面判断:一是有多饮多尿及体重减轻症状;二是血糖水平达标。实际操作中,动物多饮多尿难以定量,多通过与正常组对比饮水量及垫料潮湿程度判断。有研究[20]将高于对照组3个标准差的血糖值作为判定标准,也有[21]人建议空腹血糖大于7.0mmol/L或餐后2h血糖大于11.1mmol/L即达标。根据T2DM胰岛素相对分泌不足的特点,有文献[22]对不同血糖程度下胰岛素水平分析,血糖轻中度增加者血胰岛素水平仍要高于正常对照组,而重度增加者(大于22.2mmol/L)血胰岛素水平明显降低。笔者所在课题组结合上述文献,建议小剂量STZ法建模者,可将血糖大于等于16.7mmol/L作为判定标准。另外,王竹等[23]将血糖测定过程常见误差以鱼骨图形式进行归纳,包括禁食时间、血样处理、操作熟练程度等。血糖既是DM的主要诊断依据,又是DM病情轻重和控制情况的主要判断指标。血糖水平与造模方法密切相关,理想的模型要求血糖既要符合DM的诊断标准,又要保证造模后血糖波动范围窄。如此,才能避免血糖水平差异过大造成大鼠病理状态不一致。


二、DM动物模型在减重代谢领域的初步应用


  上述动物模型各自侧重不同,有侧重血糖者,还有侧重肥胖者,结合不同MBS手术方式,紧贴临床提出的科学问题进行研究,相互印证。


  1.糖脂代谢方面,国外有学者[24]应用ZDF大鼠,对比RYGB或袖状胃切除术(sleevegastrectomy,SG)联合术后胰岛素、强化药物治疗(胰岛素+二甲双胍+利拉鲁肽)、饮食控制三种干预方法,结果提示手术减重和降糖效果明显优于后两种干预方法;国内也有学者[25]得出短期内RYGB改善大鼠脂质代谢,减轻瘦素抵抗的效果优于单纯饮食控制。在手术对胰腺β细胞影响方面尚有争议,有文献[26]对大鼠行SG、RYGB、小肠切除术,发现RYGB组无胰腺β细胞增加,小肠切除术后胰腺β细胞显著增加。也有信号通路上的研究,有研究表明[27]SG使水通道蛋白7表达上调,可以通过由胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide1,GLP-1)而不是胃饥饿素引起甘油三酯的合成来增加细胞内甘油,用来释放胰岛素,改善胰腺脂肪变性、胰岛素抵抗。还有胆汁酸途径,有人[28]发现SG大鼠通过抑制细胞色素P4508B1同工酶等途径,使12α-羟基化胆汁酸减少,引起机体胰岛素敏感性增高。还有研究者[29]认为十二指肠-空肠旁路术大鼠胰岛β细胞功能的改善,与炎症反应减少、肝脏及脂肪组织应激活化蛋白激酶激活有关。术后胃肠激素特别是GLP-1的改变是机制研究中的热点,有研究表明[30]RYGB可引起大鼠GLP-1的高分泌;其他胃肠激素方面,GK大鼠RYGB术后肥胖抑制素增加,虽然胃饥饿素术后也增加[31],酪酪肽和内脂素水平,BPD术后酪酪肽增加,内脂素减少[32]。还有学者证明[33]行RYGB术后的wistar大鼠肠道菌群发生了明显的改变,并且可以促进对肥胖及其并发症的治疗。临床上,患者行RYGB、SG等手术后,不仅有减重降糖的收益,对相关并发症也有影响。MBS工作者可联合多学科团队从多方面开展动物实验进行验证和探索。


  2.在心血管以及糖尿病肾病方面,有研究[34]发现十二指肠-空肠旁路术和SG使大鼠G蛋白偶联受体78,磷酸化细胞外信号调节激酶和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-12降低,心肌细胞凋亡减少,达到心功能改善程度。另外有研究表明[43],控制体重还可以逆转外周血管脂肪组织的损伤。有研究[35]发现,Y型食管-空肠吻合术能改善肾功能和减轻肾小球病变,并且提出肾功能和炎症的改善并不全依赖于体重减轻,这种肾脏保护功能可归因于炎症因子的减少和纤维化的改善。


  3.雄性勃起功能障碍及雌性多囊卵巢综合症方面,有研究[36]表明,RYGB大鼠一氧化氮合酶水平高于对照组,而手术组Rho激酶和羟基脱氧鸟苷这两种损伤因素低表达,阴茎海绵体结构发生改变,可明显改善T2DM引起的勃起功能障碍。通过双氢睾酮和高脂饮食诱导的肥胖合并多囊卵巢综合症大鼠行SG术后,皮质酮、双氢睾酮水平下降使规律的发情周期得以恢复[37]。


  4.其他方面。有学者研究MBS对子代的影响[38],发现行回肠间置术大鼠子代的体重、胰岛素、胰高血糖素样肽-2、非结合胆汁酸和假手术组子代对比有统计学差异。在肥胖合并低通气阻塞性睡眠呼吸暂停综合征方面,天然大鼠实验动物模型较少,陆川猪作为一种天然动物模型[39],应用于MBS基础研究仍是空白。还有研究不同术式疗效对比,甚至探索更微创的新术式。有研究[40]对肥胖SD大鼠近(远)端小肠绕道术,发现近端小肠绕道组减重效果更佳。还有研究[41]对GK大鼠行单吻合口法胃旁路术,术后血糖及胰岛素分泌均得到改善。国内有学者[42]对GK大鼠行胆总管外引流提示胆汁酸途径降糖及胰岛素敏感性的改变不依赖于体重及摄食的影响。


三、总结与展望


  综上所述,DM动物模型分类复杂各有侧重,故需密切结合研究目的和模型特点做出最优选择。DM动物模型复制方法,随着技术发展和对糖尿病发病机理的阐明而进步,其发展给减重代谢手术机制研究带来了新的机遇。应该投入更多的精力去探索能全面复制人类糖尿病发病机制及疾病进展,且抗病能力强、便于操作、管理和购买的理想的DM动物模型。从翻译、转录、修饰、相互作用、效应充分探讨代谢手术机制。


    2019/2/24 11:32:22     访问数:170
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