心脏震波治疗抑制心肌细胞凋亡的机制研究

[目  的]

 

  心脏震波治疗(CSWT)作为一种无创的促血管新生的治疗方式,目前国内外的研究均证实其通过促进血管新生,从而改善心肌缺血及心功能,也有少部分学者在研究CSWT的试验中发现其能抑制心肌细胞凋亡,但其具体机制尚不清楚。本研究在前期试验的基础上,通过体外细胞实验验证CSWT预处理能否抑制缺血再灌注诱导的心肌细胞的凋亡,并进一步探讨CSWT是否通过激活磷酸肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸激酶(phosphatidylinositol- 3- kinase /serine threonine kinase ,PI3K/Akt)信号通路和细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)信号通路而发挥抑制心肌细胞凋亡的作用,为将来探讨CSWT预处理缺血-再灌注损伤患者保护效应的相关临床研究提供理论依据,也为今后进一步拓展CSWT治疗缺血性心肌病(IHF)的分子机制研究奠定基础。


[方  法]

 

  选用来源于胚胎期大鼠心脏组织的H9C2细胞系作为研究对象,取对数生长期的H9c2细胞,设正常对照组、缺氧/复氧组(A/R组)、CSWT+缺氧/复氧组(CSWT+A/R组)、PI3K/Akt信号通路抑制剂+ 缺氧/ 复氧组(LY294002 +A/R 组)、LY294002+CSWT+ 缺氧/ 复氧组(LY294002+CSWT+A/R 组)、ERK1/2信号通路抑制剂+ 缺氧/ 复氧组(PD98059 +A/R 组)、PD98059+CSWT+ 缺氧/ 复氧组(PD98059+CSWT+A/R 组)、LY294002+ PD98059 +缺氧/复氧组(LY294002+ PD98059 +A/R组)、LY294002+ PD98059+CSWT+缺氧/复氧组(LY294002+PD98059+CSWT+A/R组);予以CSWT预处理组均参考2004年Nishida的细胞实验方案,对每份标本均以0.09mJ/mm2能量水平给予500个脉冲波,运用模拟缺血-再灌注液培养法进行心肌细胞缺氧/复氧模型的构建,运用细胞增殖-毒性检测法(cell counting Kit-8, CCK8)比色法、流式细胞技术分别检测各组心肌细胞的增殖及凋亡情况,然后通过RT-PCR检测各组细胞培养物中Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA转录情况; Western-blot检测细胞培养物中Bcl-2、Bax、Caspase-3、p-AKT、p-ERK1/2的蛋白表达水平。为进一步研究CSWT预处理是否通过PI3K/Akt信号通路、ERK1/2信号通路调控缺氧/复氧诱导H9C2细胞的凋亡,予LY294002、PD98059处理细胞,分别阻断上述两条通路,再次检测各组心肌细胞的增殖及凋亡情况,各组细胞培养物中Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA转录情况及Bcl-2、Bax、Caspase-3、p-AKT、p-ERK1/2的蛋白表达水平。

 

[结  果]


  1、CCK8法、流式细胞技术检测各组细胞存活率及凋亡率比较:A/R组与对照组相比,细胞存活率降低,而凋亡率增加(P<0.05);与A/R组相比,LY294002+A/R组、PD98059+A/R组细胞存活率降低,凋亡率增加(P<0.05),而A/R+CSWT组比较结果则相反,且具有统计学意义(P<0.05);与A/R+CSWT组相比,LY49002+A/R+CSWT组、PD98059+A/R+CSWT组细胞存活率降低,而凋亡率增加(P<0.05)。


  2、RT-PCR检测各组细胞Bcl-2、Bax、Casepase-3的mRNA转录水平比较:与对照组相比,A/R组Bcl-2 mRNA转录水平降低,Bax和Caspase3的mRNA转录水平升高(P<0.05);与A/R组相比,LY294002+ A/R组、PD98059+A/R组Bcl-2 mRNA转录水平降低,Bax和Caspase3的mRNA转录水平升高,而A/R+CSWT组Bcl-2 mRNA转录水平升高、Bax和Caspase3的mRNA转录水平降低(均P<0.05)。与A/R+CSWT组相比,Ly49002+A/R+CSWT组、PD98059 +A/R+CSWT组Bcl-2 mRNA转录水平降低,Bax转录水平升高,且Ly49002+A/R+CSWT组的Caspase3转录水平也升高(均P<0.05),而PD98059 +A/R+CSWT组Caspase3有升高的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。


  3、Western-blot检测各组细胞Bcl-2 、Bax、 Casepase-3蛋白表达水平比较:与对照组相比,A/R组Bcl-2 蛋白相对表达量明显减少,而Bax和Caspase3的相对表达量增加(P<0.05);与A/R组相比,LY294002+ A/R组和PD98059+A/R组Bcl-2 相对表达量降低, Bax相对表达量增加,且LY294002+ A/R组Caspase3的相对表达量也增加(P<0.05),但PD98059 +A/R组Caspase3蛋白表达虽有所增加,但差异无统计学意义(P>0.05);A/R+CSWT组Bcl-2 相对表达量增加,而Bax和Caspase3的相对表达量降低(P<0.05)。与A/R+CSWT组比,LY49002+A/R+CSWT组Bcl-2 相对表达量明显降低、Bax及Caspase3相对表达量增加(P<0.05),而PD98059 +A/R+CSWT组仅Bax相对表达量明显增加(P<0.05),而Bcl-2、Caspase3的变化无统计学意义(P>0.05)。


  4、Western-blot检测各组细胞P-AKT、P-ERK蛋白表达水平比较:与对照组相比,A/R组P-AKT及P-ERK蛋白相对表达量明显降低(P<0.05),而A/R+CSWT组与A/R组相比,P-AKT及P-ERK蛋白表达明显增加( P<0.05) 。加入LY294002以后,与A/R+CSW相比,LY294002 +A/R+CSWT组P-AKT蛋白的相对表达量明显减少( P<0.05)。加入PD98059后,与A/R+CSW相比,PD98059 +A/R+CSWT组P-ERK蛋白的相对表达量明显减少( P<0.05)。


[结  论]


  1、缺氧/复氧导致H9C2细胞凋亡的发生,且其通过抑制细胞Bcl-2因子表达,促进细胞Bax、Caspase-3因子表达来实现上述效应,提示缺氧/复氧可能是通过线粒体途径介导了H9C2细胞凋亡的发生,为以后寻找减轻心肌缺血再灌注的治疗方式提供了新的靶点。


  2、PI3K/Akt信号通路和ERK1/2信号通路对H9C2细胞具有保护效应,能抑制缺氧/复氧诱导的H9C2细胞的凋亡,再一次证实RISK途径能通过多种机制促进心肌细胞的存活,为进一步研究有效防治缺血再灌注损伤的分子机制、信号通路提供了方向。

 

  3、CSWT预处理能通过激活PI3K/Akt信号通路和ERK1/2信号通路,调控其下游的凋亡相关因子的表达,抑制缺氧/复氧诱导的H9c2细胞凋亡,为将来探讨CSWT预处理缺血-再灌注损伤患者保护效应的相关临床研究提供理论依据。


    2018/10/5 11:37:02     访问数:852
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