PM2.5不同成分致冠状动脉粥样硬化大鼠ACS的可能机制

  大气颗粒物(Particulate Matter,PM)是对悬浮在大气中固体和液体颗粒物的总称,其中空气动力学直径≤2.5μm的颗粒物称为PM2.5[1-3]。由于PM2.5粒径较小,可直接进入肺泡并沉积,并可通过肺泡进入血液,而且大部分有害元素和化合物都富集于PM2.5上,因而对人体健康造成的危害更大[1, 4-6],目前正逐渐引起学者的重视,受到普遍关注。大量流行病学研究发现,空气中PM2.5浓度的增高与心肺疾病的超额发病率、死亡率相关[7-9]。美国国家环保局(EPA)进行的两项前瞻性队列研究表明,总死亡率及心肺疾病死亡率的上升与大气中PM2.5浓度增高相关[10, 11]。还有研究表明[12],急性心肌梗死(AMI)前2 h24 h内大气颗粒物污染程度与AMI发病明显正相关;发病前2小时PM2.5每增加25 μg/m3,AMI发生危险增加48%,发病前24 h PM2.5每增加20 μg/m3,AMI发生危险增加69%,提示PM2.5对心血管系统具有潜在毒性。可见,在心血管疾病的发生中,大气颗粒污染物是一个不可忽视的因素。本实验在建立冠脉粥样硬化大鼠模型的基础上,提取PM2.5的水溶性及酸溶性成分,分别染毒模型及正常大鼠,通过对一些易损斑块标志物的检测,来探讨PM2.5不同成分致冠状动脉粥样硬化大鼠ASC的可能机制。

1.材料与方法

  1.1实验动物与试剂 雄性Wistar大鼠,PM2.5(样品来源于美国国家标准技术研究院,标号﹟2783),丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所第一分所),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6IL-6)放射免疫试剂盒(解放军总医院科技开发中心放免所),NF-κB p65单克隆抗体(Santa Cruze公司)

  1.2动物模型的建造 48只健康雄性Wistar大鼠,体重180-220g,适应性喂养1周后,随机分为2组,对照组和冠状动脉粥样硬化模型组(简称模型组),每组各24只。模型组饲喂高胆固醇饲料(4%胆固醇、10%猪油、5%白糖、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、80.3%基础饲料),并在饲养开始时,腹腔注射VD3 2ml/kg(60IU/kg)。对照组饲喂普通饲料,并在饲养开始时,腹腔注射生理盐水2ml/kg。12周后模型建成。

  1.3 PM2.5不同成分的提取 将400mg PM2.5溶于10 mL双蒸水中,室温下搅拌溶解60min,再超声震荡3次,30/次,然后4℃离心,20000转×60分钟,收集上清,最后经三层滤纸过滤,所得滤液即为PM2.5水溶性成分(WSC),其终浓度为40mg/mL4℃贮存备用。将WSC提取过程中离心后所留沉淀物置于70℃干燥箱24 h,使其充分干燥,再将干燥物10ml浓度为1mol/LHCl溶解,搅拌、震荡、离心、过滤操作同前,所得滤液即为PM2.5酸溶性成分(ASC),其终浓度为40mg/ml4℃贮存备用,使用前用NaOH溶液滴定至pH7.357.45

  1.4染毒及分组 以尾静脉注射的方式进行染毒。将饲喂12周后的对照组和模型组再各自随机分为三组,分别为正常对照组、WSC对照组、ASC对照组,以及模型对照组、WSC模型组、ASC模型组,每组8。WSC对照组和WSC模型组(合称为WSC组)给予WSC(40mg/kg染毒,ASC对照组和ASC模型组(合称为ASC组)给予ASC(40mg/kg染毒,而正常对照组和模型对照组(合称为空白组)则以尾静脉注射生理盐水进行对照。染毒24h后,处死大鼠,留取血清和心肌组织待测。

  1.5指标的测定 MDA、SOD采用化学法测定;IL-6、TNF-α采用放射免疫法测定;NF-κB采用免疫组织化学法测定。

  1.6统计学处理 所有的测量结果以均数±标准差(

)表示,数据处理采用统计软件SPSS10.0在计算机上完成。本实验涉及两个因素(模型因素、染毒因素),而两个因素又分别有不同的水平(模型因素包括对照、模型两个水平,染毒因素包括空白、WSC、ASC三个水平),通过析因设计分析各因素的作用以及是否存在交互作用,而各组之间的比较则采用了析因设计的Bonferroni检验,P<0.05有统计学意义。

2.结    果

  2.1各组MDA的比较 析因设计结果表明(表1),染毒因素、模型因素对MDA均没有显著影响,而且两者之间也不存在交互作用。各组之间的方差分析结果显示(表2):模型组高于对照组,ASC组高于对照组。 ASCAS模型对MDA均有升高作用。


1  MDA析因设计

F

Sig

Eta Squared

染毒组别

1.556

0.207

0.061

模型组别

3.004

0.056

0.077

染毒组别﹡模型组别

2.145

0.058

0.152

2  各组MDA比较

)(nmol/ml)

染毒组别

模型组别

合 计

对照组

模型组

空白组

7.12±0.45

7.42±0.65

7.24±0.66

WSC组

7.29±0.26

8.21±1.75

7.78±1.21

ASC组

7.19±0.63

10.01±3.99

8.27±2.702)

合 计

7.21±0.66<, /P>

8.34±2.491)

注:1) :模型组与对照组相比较P<0.052):染毒组与空白组相比较P<0.05


2.2各组SOD的比较 析因设计结果表明(表3):染毒因素对SOD具有显著影响,模型因素对SOD无显著影响,而且两者之间也不存在交互作用。方差分析结果显示(表4):ASC组低于空白组。ASC有降低SOD的作用。


3  SOD析因设计

F

Sig

Eta Squared

染毒组别

12.910

0.001

0.356

模型组别

2.492

0.090

0.066

染毒组别﹡模型组别

0.926

0.482

0.074

4  各组SOD比较

)(U/ml)

染毒组别

模型组别

合 计

对照组

模型组

空白组

127.95±5.23

133.46±1.47

130.38±5.69

WSC组

128.48±4.02

129.84±6.39

129.00±4.53

ASC组

117.25±11.38

119.65±7.54

118.56±8.921)

合 计

122.51±9.55

123.91±10.64

注:1):染毒组与空白组相比较P<0.05


  2.3各组IL-6的比较 析因设计结果表明(表5):模型因素对IL-6具有显著影响,染毒因素对IL-6虽无显著影响,但却与模型因素存在显著的交互作用,各影响因素对IL-6总变异的贡献依次为:两因素的交互作用>模型因素。各组之间的方差分析结果显示(表6):模型组高于对照组。AS模型可升高IL-6;而且染毒因素与模型因素还存在一定的交互作用,表现在AS模型与WSCASC对于IL-6的升高具有协同作用。


5  IL-6析因设计

F

Sig

Eta Squared

染毒组别

0.365

0.778

0.017

模型组别

12.120

0.001

0.281

染毒组别﹡模型组别

5.932

0.001

0.365

6  各组IL-6比较

)(pg/ml)

染毒组别

模型组别

合 计

对照组

模型组

空白组

61.09±17.14

48.18±15.49

53.77±15.41

WSC组

19.96±9.10

65.43±10.03

48.72±23.50

ASC组

24.21±7.12

54.54±18.59

42.70±28.66

合 计

37.94±22.61

55.06±15.931)

注:1) :模型组与对照组相比较P<0.05


  2.4各组TNF-α的比较 析因设计结果表明(表7):染毒因素、模型因素对TNF-α均有显著影响,而两者之间的交互作用并不显著;两因素对TNF-α总变异的贡献分别为:模型因素>染毒因素。各组之间的方差分析结果显示(表8):模型组高于对照组;WSC组高于空白组。WSC及AS模型对TNF-α均有升高作用。


7  TNF-α析因设计

F

Sig

Eta Squared

染毒组别

8.596

0.001

0.272

模型组别

18.531

0.001

0.349

染毒组别﹡模型组别

1.042

0.406

0.083

8  各组TNF-α比较(

)(ng/ml)

染毒组别

模型组别

合 计

对照组

模型组

空白组

1.84±0.27

2.99±0.51

2.53±0.76

WSC组

2.42±0.63

3.28±0.82

2.83±0.972)

ASC组

2.02±0.44

3.12±0.90

2.53±0.77

合 计

2.02±0.48

3.13±0.791)

注:1) :模型组与对照组相比较P<0.052):染毒组与空白组相比较P<0.05


  2.5各组NF-κB免疫组化检测 NF-κB正常情况下处于失活状态,存在于胞浆中,所以正常对照组可见蓝染的胞核,并有黄色颗粒物分布于胞浆。当NF-κB被激活时,就会由胞浆进入胞核,称为核易位,在NF-κB激活的阳性细胞中可见,胞核在蓝色的基础上着有棕色,呈现出深棕色,胞浆中黄色颗粒物减少。在本实验中,每张切片随机挑取3个视野,计数核易位的细胞数目,计算平均核易位率。NF-κB核易位率的析因设计结果表明(表9):染毒因素、模型因素对NF-κB核易位率均有显著影响,而且两者之间还存在有显著的交互作用;三者对NF-κB核易位率总变异的贡献依次为:模型因素>染毒因素>两因素的交互作用。各组之间的方差分析结果显示(表10):模型组高于对照组;WSC组与ASC组均高于空白组。该结果表明:ASC、WSC及AS模型对NF-κB核易位率均有升高作用;而且染毒因素与模型因素还存在一定的交互作用,表现在AS模型与WSCASC对于升高NF-κB核易位率具有协同作用。



3.讨    论

  PM2.5是一个物理概念,是一个由其上所吸附的各种物质所组成的混合物,其毒性作用主要是通过其上所吸附的物质来实现的。目前已知的PM2.5的化学成分包括可溶性成分(无机离子,如NO3-、SO42-)、有机成分(如多环芳烃(PAHs)等)、微量元素等[3]。到目前为止,PM2.5健康效应的生物学起因和作用机制尚不十分清楚。一些研究表明,PM2.5的生物学效应主要与颗粒物吸附的有机化合物种类及含量有关[13];另一些研究则表明,无机成分,特别是其中的一些过渡金属起着重要的作用[14, 15]。而在本研究中所关注的则是PM2.5的水溶性成分和酸溶性成分。根据实验所得结果对PM2.5两种成分对冠状动脉粥样硬化大鼠的心脏毒性作用加以探讨分析。

  3.1氧化应激损伤:本研究显示:PM2.5酸溶性成分染毒组较其余各组染毒后SOD降低最为显著,说明PM2.5酸溶性成分可使机体抗氧化能力降低。另外,PM2.5上的一些吸附物质代谢产生自由基,或生成活性中间产物再引发自由基反应,攻击体内脂质中的多不饱和脂肪酸,使之过氧化,从而增加细胞的脆性,损伤巯基酶,对细胞产生毒性效应。MDA是细胞发生脂质过氧化反应中具有代表性的产物,其含量的多少预示脂质过氧化的速率和强度。本次实验显示:PM2.5酸溶性成分染毒组MDA显著高于其余各组,说明PM2.5酸溶性成分作用于大鼠后,引发了脂质过氧化作用,形成了较多的脂质过氧化物。同时又由于抗氧化能力的下降,使机体清除自由基的能力降低。通过研究表明,大气污染物能够激发体内的脂质过氧化反应,使体内氧化和抗氧化系统失去平衡[16],进而造成大鼠脂质过氧化损伤,大量形成ox-LDL,通过受损的内膜,堆积于血管壁,加重血管的动脉粥样硬化变。同时脂质过氧化作用发生于血管内皮细胞时,还会进一步加重内皮的损伤,继而引起一系列改变。如血管内皮裂隙增大,通透性增加,促使脂质在血管内膜下沉积,加重AS;破损的内皮还可促进单核巨噬细胞趋化并激活分泌各种炎症和细胞因子,如IL-1β、IL-8IL-6TNF-α等,令血管白细胞移动改变从而导致血液流动性降低,引起血管重塑,使血管变得僵硬压力负荷增加,进一步加剧AS。由此可见,PM2.5酸溶性成分具有氧化损伤作用,推测这至少是PM2.5加重AS的途径之一。

  3.2加剧炎症反应:本研究从血清炎性指标TNF-α、IL-6及心肌组织NF-κB两方面,对PM2.5染毒后对机的炎症作用进行了探讨。结果表明:PM2. 5染毒后,TNF-α、IL-6及心肌组织NF-κB均显著升高,其中酸溶性成分染毒后以IL-6NF-κB升高为主,而水溶性成分染毒后则表现在TNF-α及NF-κB的升高。说明细颗粒物对机体具有潜在炎性损伤毒性。炎性损伤不但可以加重AS病变处的炎症反应,同时还能继发性引起机体炎症细胞向病变处聚集,促进单核细胞、巨噬细胞的粘附并向血管内皮下迁移、侵润,从而加重AS的发生与发展。

参 考 文 献:

[1]戴海夏, 宋伟民. 大气PM2.5的健康影响[J]. 国外医学:卫生学分册, 2001,28(5):299-303.

[2]戴海夏, 宋伟民. 大气颗粒物健康效应生物学机制研究进展[J]. 环境与职业医学, 2003,20(4):308-311.

[3]赵厚银,邵龙义,时宗波. 室内空气PM25研究现状及发展趋势[J]. 环境与健康杂志, 2003,20(5):310-312.

[4]Dockery DW, Pope CA 3rd. Acute respiratory effects of particulate air pollution[J]. Annual Rev Public Health, 1994,15:107-132.

[5]周中平,赵寿堂,朱立,等. 室内污染检测与控制[M]. 北京:化学工业出版社,2002:391.

[6]邵龙义, 黄勤. 都市大气环境中可吸入颗粒物的研究[J]. 环境保护, 2000,(1):24-26,29.

[7]Saldiva PH, Pope CA 3rd, Schwartz J, et al. Air pollution and mortality in elderly people: a time-series study in Sao Paulo, Brazil[J]. Arch Environ Health, 1995,50(2):159-163.

[8]Ballester F, Tenias JM, Perez-Hoyos S. Air pollution and emergency hospital admissions for cardiovascular diseases in Valencia, Spain[J]. J Epidemiol Community Health, 2001,55(1):57-65.

[9]Daniels MJ, Dominici F, Samet JM, et al. Estimating particulate matter-mortality dose-response curves and threshold levels: an analysis of daily time-series for the 20 largest US cities[J]. Am J Epidemiol, 2000,152(5):397-406.

[10]Schwartz J. Harvesting and long term exposure effects in the relation between air pollution and mortality[J]. Am J Epidemiol, 2000,151(5):440-448.

[11]Gamble JF. PM2.5 and mortality in long-term prospective cohort studies: cause-effect or statistical associations? [J]. Environ Health Perspect, 1998,106(9):535-549.

[12]Peters A, Dockery DW, Muller JE, et al. Increased particulate air pollution and the triggering of myocardial infarction[J]. Circulation, 2001,103(23):2810-2815.

[13]Hiura TS, Kaszubowski MP, Li N, et al. Chemicals in diesel exhaust particles generate reactive oxygen radicals and induce apoptosis in macrophages[J]. J Immunol, 1999,163(10):5582-5591.

[14]Ghio AJ, Stonehuerner J, Dailey LA, et al. Metals associated with both the water-soluble and insoluble fractions of an ambient air pollution particle catalyze an oxidative stress[J]. Inhal Toxicol, 1999,11(1):37-49.

[15]Prahalad AK, Soukup JM, Inmon J, et al. Ambient air particles: effects on cellular oxidant radical generation in relation to particulate elemental chemistry[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 1999,158(2):81-91.

[16]赵毓梅, 赵五红. 大气总悬浮颗粒物的肺毒性及抗毒性实验研究[J]. 环境与健康杂志, 1998,15(1):1-4.

 


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