冠心病心绞痛不同中医证型的代谢组学比较研究

作者:陈浩[1] 邓悦[1] 
单位:长春中医药大学附属医院[1]

代谢组学作为新兴起的一门系统生物学已经被各学者广泛应用于中医药领域的研究中,它具有终点放大的特点并且可以从网络终端表象的整体角度反映生物体的功能水平,与中医学的整体观念相近,因此,代谢组学技术的引进和利用为中医证候的客观化提供了崭新的平台[1]。另一方面,严重威胁人类健康的冠心病,它具有病情重,病位深,病程长,且多反复发作、正气多虚、脏腑多损等特点。人们意识到,如果能在器质性疾病形成之前及早的预防,或是延缓病情的发生发展,将会有效的降低冠心病乃至心血管事件链的死亡率。本研究在冠心病心绞痛中医证候流行病学调查研究的基础上,掌握了冠心病心绞痛中医证候的特征规律,发现双因素证型中气虚血瘀和痰瘀互证型分别位居第一第二位,而三因素证型中气虚血瘀痰浊位据首位;根据以上理论,利用代谢组学中液相色谱-质谱联用的技术,分析冠心病心绞痛不同证型间的尿液、血清的代谢产物,探寻中医证候的客观化规律,为冠心病心绞痛的有效防止提供参考和依据。

1 病例标本:

1.1 一般资料:健康人来源于长春中医药大学附属医院体检确定其身体健康的志愿者,病理组来源于长春中医药大学附属医院心内科住院部的患者。所有患者都符合相应的中西医诊断标准和中医诊断标准。如下表

1.2 诊断标准:西医诊断标准参照1979 年国际心脏病学会及世界卫生组织临床命名标准化联合专题报告《缺血性心脏病的命名及诊断标准》以及2010 年《稳定型冠心病诊治指南》制定冠心病心绞痛的诊断。中医诊断标准参照中国中西医结合学会心血管学会1990 年10 月修订《冠心病中医辨证标准》。

2 样品取材与预处理:受试者取清晨空腹尿液10ml,3000r/min 离心10min 后,取上清分装至-80℃冰箱保存;患者采血前1 天素食,次日清晨经肘静脉抽取受试者空腹12h 静脉血2--3ml,室温下经3000 r/min 离心后10min 后,取血清至-80℃冰箱保存;健康人同上。统一送至长春应用化学研究所进行代谢组学尿液及血清检测。

3 数据采集与分析:尿液和和血清检测均使用Waters Acquity UPLC 液相色谱系统、Q- TOF SYNAPT G2 HDMS 质谱仪和Waters CQUITY UPLC BEH C18 色谱柱(1.7μm, 2.1×50 mm) 进行液相色谱质谱联用进行数据采集。数据分析均使用EZinfo 2.0 软件中的PCA 和OPLS-DA 进行多元变量分析。使用SPSS17.0 软件进行组间独立样本方差检验。使用生物学数据库,如HMDB (http://www.hmdb.ca/)进行生物标志物的鉴定和代谢通路的分析。

4 结果

4.1 尿液PCA分析结果如图1、图2

4.2 血清PCA 分析结果如图3、图4

在PCA得分图中每一个点代表一个样品,每个样品的位置由其自身的代谢决定,处于相同生理病理的样品通常具有相似的代谢物,因此得分图上处于相近的地理位置。若彼此间的差距越大,也就表明其生理病理状态相差越大。

4.3 尿液OPLS-DA分析结果

对气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组的尿液进行OPLS-DA 分析,建立模型,得出S-plot 图如图5、图6

4.4 血清OPLS-DA分析结果如图7、图8

分散在S型两端的散点越远,越具有特异性。

4.5 对潜在是生物标志进行检索:分散在S 型两端的点作为潜在的生物标志物,

选择其中VIP 值大于1.0 的分子量且独立t 检验的P<0.05 的化合物作为潜在的生物标志物,通过精确分子量在生物数据库进行正谱和负谱检索,选取可以解释代谢通路且具有代表意义的物质,尿液中检测出:马尿酸(精确分子量179.1727)、生物素(精确分子量244.311)、天冬氨酰蛋氨酸(精确分子量264.299)、赖氨酰酪氨酸(精确分子量309.3608)、半胱氨酸亚磺酸(精确分子量151.118)、氨基葡萄糖(精确分子量179.1711)、果糖胺(精确分子量179.1711)、磷脂酰甘油(精确分子量512.6142);血清中检测出甘油三酯(精确分子量815.2992)、甘氨胆酸(精确分子量465.6227)等,对这些物质在三组之间进行方差和标准差的分析,并且得到变化趋势,如下表

5 讨论与展望

从在PCA 得分图分析,尿液检测中,正离子模式下三组之间的地理位置存在着明显差异,提示三组间的体内代谢通路存在本质的差异;在负离子模式下,健康组和气虚血瘀、气虚血瘀痰浊这两组的代谢通路有明显差异。而血清检测中,负离子模式下三组之间的代谢物通路存在着明显差异;在正离子模式下,气虚血瘀痰浊组可以明显和健康组和气虚血瘀组区分开来。根据表2 中,各标志物的标准差、方差及变化趋势,提示尿液中的马尿酸、氨基葡萄糖、果糖胺:气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组虽然均高于气虚血瘀组,但是气虚血瘀组和健康组之间没有差异性,提示这三种物质可能代表了气虚血瘀痰浊的特异性,而决定差异性存在的是痰浊这种病理因素;血清中的甘油三酯:气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组的甘油三酯都高于健康组,但是气虚血瘀组和健康组没有明显差异,提示甘油三酯在气虚血瘀痰浊组中有很高的含量,可以推测甘油三酯是痰浊这种病理因素的潜在性生物标志物。马尿酸过多反映了肠道微生物菌群失调,氨基葡萄糖、果糖胺的过多反应了糖代谢的紊乱,甘油三酯的过多反应了脂类、能量代谢的紊乱,所以临床中对痰浊证型的患者,要预防胃肠功能紊乱而致的肠道疾病以及要密切关注血糖、血脂的水平。我们检测出马尿酸、氨基葡萄糖、果糖胺这三种物质可能是痰浊证潜在的生物标志物,与张红栓等[2]通过对冠心病心绞痛患者的尿液代谢组学检测,发现血瘀证和痰浊证两组的代谢物可以明显区分,且痰浊证组的柠檬酸、酪氨酸、马尿酸等的含量高于血瘀证组具有高度相似性。

天冬氨酰蛋氨酸、半胱氨酸亚磺酸:气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组均高于健康组组,气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组之间没有差异性,提示天冬氨酰蛋氨酸、半胱氨酸亚磺酸可能为气虚血瘀中特异性标志物,而在气虚血瘀痰浊中并无特异性。天冬氨酰蛋氨酸是由天门冬氨酸和蛋氨酸组成的二肽,这是蛋白质分解代谢的不完整的的分解产物,表明蛋白质处于高代谢的一个状态,所以气虚血瘀证在饮食上是需要补充一定的蛋白质营养。半胱氨酸亚磺酸是氧化还原酶和天门冬氨酸氨基转移酶的副产品,当天门冬氨酸氨基转移酶升高时,提示肝脏疾病可能引起的肝损伤,临床中气虚血瘀证可能存在潜在的肝损伤,需谨慎治疗。

生物素、赖氨酰酪氨酸、磷脂酰甘油、甘氨胆酸这四种物质气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组均低于健康组,气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组之间没有差异性,提示气虚血瘀证和气虚血瘀痰浊证均缺少这些物质。生物素又称维生素H、辅酶R,也属于维生素B 族中的B7,它是合成维生素C 的必要物质。赖氨酰酪氨酸是赖氨酸和酪氨酸形成的双肽,两种氨基酸都是人体所需要的营养物质,为蛋白质的

吸收和利用提供基础。磷脂酰甘油是一种酸性磷脂,磷脂具有促进脂肪代谢,降低血清胆固醇、改善血液循环、预防心血管疾病的作用。甘氨胆酸是由胆酸和甘氨酸结合生成的,然后随胆汁排入肠道,帮助脂肪的消化和吸收。所以临床治疗中,对于气虚血瘀证和气虚血瘀痰浊证都要注意维生素、氨基酸等营养物质的补充以及控制脂类代谢的紊乱。

系统生物学的研究方法和中医学体系的整体观念存在着许多的相似性,但将二者结合起来也面临诸多挑战,特别是中医证候的复杂多变性,这就需要技术成熟发展,但是代谢组学的无创性、高灵敏性的分析特点,更易于为中医药的现代

化所接受,也为目前中医药的研究开辟了新的方法和思路,有望使中医辨证实现客观化[3]。

参考文献

[1] 朱萱萱,王广基,阿基业,等.冠心病中医辨证分型的代谢组学研究[J].中华

中医药学刊,2009,27(6):1267-1269.

[2 张红栓,贾钰华,华何与,等.冠心病心绞痛痰浊证、血瘀证的尿液代谢组学

研究[J].中国中医基础医学杂志,2010,16(2):126-128.

[3] 程鹏.冠心病痰浊证气虚证的代谢组学研究[D].中南大学,2012.

[4] 齐瑶.乌头汤及其禁忌配伍的化学和代谢组学研究[D].中国科学院大学,

2014.

[5] 钱国华,荀鹏程,陈峰,等.偏最小二乘法降维在微阵列数据判别分析中的应用[J].中国卫生统计,2007,24(2):120-123.

[6] 朱明丹.不同证型冠心病患者的血浆代谢组学研究[J].中医杂志,2013,

54(17):1489-1493.


    2016/7/12 9:20:23     访问数:1119
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