β-catenin 对大鼠脂肪间充质干细胞成牙骨质分化分化的调控作用

背景:
   在慢性牙周炎导致的牙周组织缺损再生中,功能性牙周再生的关键在于牙骨质的生成。成牙骨质细胞(CBs)在体外可以形成牙骨质基质,并且介导新生骨、牙周膜及牙槽骨的生成,达到完全意义的牙周再生。然而CBs数量极少,分离困难,因此其应用受到极大的限制。脂肪干细胞(adipose derived stem cells, ADSCs)具有多向分化能力,并可在体外大量扩增,且有研究证实, ADSCs可以牙向分化为类成牙骨质样细胞及牙本质-牙髓复合体样结构。目前大量研究证实Wnt/β-catenin 信号通路在干细胞的分化调控中发挥重要作用,然而在ADSCs的成牙骨质分化过程中β-catenin的作用机制仍不明确。
目的:
   探索β-catenin 在牙囊细胞条件培养液(Dental Follicle Cell-Conditioned Medium ,DFC-CM)诱导ADSCs向成牙骨质细胞分化过程中的作用机制。
方法:
   分培养大鼠脂肪细胞,采用免疫磁珠法获取纯化的ADSCs。分离培养大鼠的牙囊细胞,并制备DFC-CM。用DFC-CM对ADSCs诱导7天,real time PCR、Western Blot 检测成牙骨质细胞关键基因、蛋白(CAP, ALP, BSP及OPN)的表达;免疫荧光检测DFC-CM诱导7天后ADSCs 中Wnt经典信号通路关键蛋白β-catenin的表达,real time PCR检测Wnt经典通路下游关键转录因子LEF-1及TCF-4 的表达。用含大鼠重组蛋白DKK-1(Wnt/β-catenin经典信号通路抑制剂)的DFC-CM 诱导ADSCs,7天后Western Blot检测DKK-1对β-catenin及Wnt经典信号通路中游GSK3β的表达,real time PCR检测LEF-1及TCF-4 的表达;免疫荧光检测对照组及DFC-CM诱导组加入DKK-1后ADSCs 细胞内ACP及BSP 的表达;real time PCR检测DKK-1抑制ADSCsβ-catenin后CAP, ALP, BSP及d OPN基因表达,Western Blot检测BSP及CAP蛋白的表达。
结果:
   1. DFC-CM 诱导ADSCs 后其成骨质分化关键基因表达显著增高,其中与对照组相比CAP增高 15.1247 倍、 ALP增高4.0856 倍、 BSP增高 3.3543 倍、OPN增高 3.1054倍(图1A)。Western Blot检测结果显示CAP, ALP, BSP及OPN(图1B,C)蛋白表达水平也显著高于对照组。
   2. 免疫荧光结果显示在对照组及DFC-CM诱导组ADSCs细胞浆与细胞核中均表达β-catenin,但是DFC-CM组β-catenin荧光表达强度低于对照组(图2A)。在细胞核内β-catenin 作用于LEF/TCF而启动下游靶基因的表达。Real time PCR 结果显示在DFC-CM诱导条件下 ADSCs 的LEF-1 及TCF-4 基因表达水平显著低于对照组(图2B)。
   3.对照组及DFC-CM诱导组加入DKK-1 100 ng/mL培养7d后ADSCs中β-catenin表达水平显著降低,其中DFC-CM+ DKK-1组蛋白降低水平最显著(图3A)。DFC-CM组GSK3β蛋白水平高于对照组,当加入DKK-1后DFC- CM 组GSK3β并未产生显著变化(图3A)。Real time PCR 结果显示对照组及DFC-CM诱导组加入DKK-1后ADSCs中 LEF-1(图3B)及TCF-4 (图3C)的表达水平显著降低。免疫荧光结果显示DFC-CM+DKK-1组BSP及CAP表达增强(图3D),对照组加入DKK-1后ADSCs成牙分骨质化关键基因CAP, ALP, BSP及OPN的表达无显著性差异,而DFC-CM组入DKK-1后ADSCs成牙分骨质化关键基因CAP, ALP, BSP及OPN的表达水平显著升高(图3E)。
结论:
   本研究证实ADSCs可作为牙再生的种子细胞,DFC-CM可为ADSCs的成牙骨质方向分化提供必需的微环境。β-catenin在DFC-CM诱导ADSCs成牙骨质分化中发挥关键作用,抑制β-catenin可增强DFC-CM诱导条件下ADSCs的成牙骨质分化能力。
关键词:
   β-catenin;脂肪间充质干细胞;成牙骨质;分化


图1. DFC-CM诱导 ADSCs向成牙骨质细胞分化。 A:Real time PCR检测成牙骨质相关基因表达;B:Western Blot检测蛋白表达水平;C:灰度分析,与对照组相比 *P<0.05

图2.β-catenin 及下游基因在ADSCs 成牙骨质方向分化过程中的表达。A:免疫荧光检测β-catenin在细胞浆及细胞核中的表达。B:Real time PCR检测 LEF-1及TCF-4在ADSCs 成牙骨质分化中的表达。

图3.抑制β-catenin 活性对ADSCs 成牙骨质分化的影响。A:DKK-1抑制β-catenin后Western Blot检测β-catenin,GSK3β的表达水平。Real time PCR检测加入DKK-1后 LEF-1(B)及TCF-4(C)的表达。D:免疫荧光检测阻断β-catenin后DFC-CM对ADSCs的诱导作用。E:Real time PCR检测CAP、ALP、BSP和OPN的表达。


    2015/11/5 16:18:26     访问数:1190
    转载请注明:内容转载自365医学网

大家都在说       发表留言

客服中心 4000680365  service@365yixue.com
编辑部   editor@365yixue.com

365医学网 版权所有 © 365heart All Rights Reserved.

京ICP备12009013号-1
京卫网审[2013]第0056号
京公网安备110106006462号
京ICP证041347号
互联网药品信息服务资格证书(京)-经营性-2018-0016  
搜专家
搜医院
搜会议
搜资源
 
先点击
再选择添加到主屏