背景：
在慢性牙周炎导致的牙周组织缺损再生中，功能性牙周再生的关键在于牙骨质的生成。成牙骨质细胞（CBs）在体外可以形成牙骨质基质，并且介导新生骨、牙周膜及牙槽骨的生成，达到完全意义的牙周再生。然而CBs数量极少，分离困难，因此其应用受到极大的限制。脂肪干细胞（adipose derived stem cells, ADSCs）具有多向分化能力，并可在体外大量扩增，且有研究证实， ADSCs可以牙向分化为类成牙骨质样细胞及牙本质-牙髓复合体样结构。目前大量研究证实Wnt/β-catenin 信号通路在干细胞的分化调控中发挥重要作用，然而在ADSCs的成牙骨质分化过程中β-catenin的作用机制仍不明确。
目的：
探索β-catenin 在牙囊细胞条件培养液（Dental Follicle Cell-Conditioned Medium ，DFC-CM）诱导ADSCs向成牙骨质细胞分化过程中的作用机制。
方法：
分培养大鼠脂肪细胞，采用免疫磁珠法获取纯化的ADSCs。分离培养大鼠的牙囊细胞，并制备DFC-CM。用DFC-CM对ADSCs诱导7天，real time PCR、Western Blot 检测成牙骨质细胞关键基因、蛋白（CAP, ALP, BSP及OPN）的表达；免疫荧光检测DFC-CM诱导7天后ADSCs 中Wnt经典信号通路关键蛋白β-catenin的表达，real time PCR检测Wnt经典通路下游关键转录因子LEF-1及TCF-4 的表达。用含大鼠重组蛋白DKK-1（Wnt/β-catenin经典信号通路抑制剂）的DFC-CM 诱导ADSCs,7天后Western Blot检测DKK-1对β-catenin及Wnt经典信号通路中游GSK3β的表达，real time PCR检测LEF-1及TCF-4 的表达；免疫荧光检测对照组及DFC-CM诱导组加入DKK-1后ADSCs 细胞内ACP及BSP 的表达；real time PCR检测DKK-1抑制ADSCsβ-catenin后CAP, ALP, BSP及d OPN基因表达，Western Blot检测BSP及CAP蛋白的表达。
结果：
1. DFC-CM 诱导ADSCs 后其成骨质分化关键基因表达显著增高，其中与对照组相比CAP增高 15.1247 倍、 ALP增高4.0856 倍、 BSP增高 3.3543 倍、OPN增高 3.1054倍（图1A）。Western Blot检测结果显示CAP, ALP, BSP及OPN（图1B，C）蛋白表达水平也显著高于对照组。
2. 免疫荧光结果显示在对照组及DFC-CM诱导组ADSCs细胞浆与细胞核中均表达β-catenin，但是DFC-CM组β-catenin荧光表达强度低于对照组（图2A）。在细胞核内β-catenin 作用于LEF/TCF而启动下游靶基因的表达。Real time PCR 结果显示在DFC-CM诱导条件下 ADSCs 的LEF-1 及TCF-4 基因表达水平显著低于对照组（图2B）。
3.对照组及DFC-CM诱导组加入DKK-1 100 ng/mL培养7d后ADSCs中β-catenin表达水平显著降低，其中DFC-CM+ DKK-1组蛋白降低水平最显著（图3A）。DFC-CM组GSK3β蛋白水平高于对照组，当加入DKK-1后DFC- CM 组GSK3β并未产生显著变化（图3A）。Real time PCR 结果显示对照组及DFC-CM诱导组加入DKK-1后ADSCs中 LEF-1（图3B）及TCF-4 （图3C）的表达水平显著降低。免疫荧光结果显示DFC-CM+DKK-1组BSP及CAP表达增强（图3D），对照组加入DKK-1后ADSCs成牙分骨质化关键基因CAP, ALP, BSP及OPN的表达无显著性差异，而DFC-CM组入DKK-1后ADSCs成牙分骨质化关键基因CAP, ALP, BSP及OPN的表达水平显著升高（图3E）。
结论：
本研究证实ADSCs可作为牙再生的种子细胞，DFC-CM可为ADSCs的成牙骨质方向分化提供必需的微环境。β-catenin在DFC-CM诱导ADSCs成牙骨质分化中发挥关键作用，抑制β-catenin可增强DFC-CM诱导条件下ADSCs的成牙骨质分化能力。
关键词：
β-catenin；脂肪间充质干细胞；成牙骨质；分化
